利用鼻咽癌细胞与组织共培养模型探讨候选鼻咽癌骨转移相关基因

论文摘要

作为一种晚期恶性肿瘤的常见并发症,骨转移的发生率约占全身转移性肿瘤的15%-20%,仅次于肺转移和肝转移,居第三位。而在某些恶性肿瘤中,骨转移的发生率要远远高于其他肿瘤,如多发性骨髓瘤（95%-100%）,乳腺癌和前列腺癌（65%-75%）,肺癌（30%-40%）。临床上骨转移常导致局部剧烈疼痛、病理性骨折、威胁生命的高钙血症、脊髓压迫等神经症状,严重影响患者的生存质量,而且通常难以治愈。骨转移的发生机制在于肿瘤细胞本身的特性、骨骼局部适宜肿瘤生长的微环境及两者之间的相互作用。在骨转移的发生过程中,由于骨组织微环境与肿瘤细胞的相互作用,使得肿瘤细胞具有特定的基因型,这种基因型在恶性肿瘤骨转移的诊断与疗效评估上正发挥越来越大的作用,亦可成为临床治疗恶性肿瘤骨转移的理论依据。根据对乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌的研究以及MILANO软件分析,筛选出CXCR4、CTGF、MMP-1、IL-11、MST1R、ETV-1、COX2、OPN、ITGB3（CD61）、EZH2、Tiam1、PTHrP、SALP、PLAU、CD44、OPG、Pleiotrophin、ADAMTS1、Erizin、TGF-β等二十个基因作为与鼻咽癌骨转移发生发展密切相关的基因,它们通过不同的作用如:化学趋向作用、增强肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附性、降解局部基质、促进血管生成等作用促进恶性肿瘤骨转移的发生。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方及东南亚地区常见肿瘤之一,尤以广东省珠江三角洲一带多见,故有“广东瘤”之称。流行病学调查显示在广东省鼻咽癌发病率可达男性30/10万人口,女性13/10万人口,足见其危害性之大。鼻咽癌远处转移最常见的部位是骨,据报道骨转移在晚期鼻咽癌患者中的检出率约为75%,中位生存期为5-9个月。因此,深入研究鼻咽癌骨转移的分子机制,对于诊断并综合各种手段有效控制骨痛和减少骨相关事件的发生,有着重要的意义。采用SYBR GreenⅠQRT-PCR（quantitatie realtime PCR）技术对靶基因进行实时荧光定量分析是近年来发展起来的一项新技术。SYBR GreenⅠ是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料,因此,它的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量,对靶基因进行定量分析,准确性和灵敏性都比普通RT-PCR高,并且通过熔解曲线的分析,排除非特异性扩增的干扰。通过2-ΔΔCT方法利用SYBR GreenⅠQRT-PCR技术能够很好的分析基因表达相对差异。用2-ΔΔCT方法分析基因表达相对定量的方法在很多文献中有报道,由于这种方法无需做标准曲线,因此比绝对定量方法更加简便可行。目前国内外关于鼻咽癌骨转移的研究并不多见,加上建立鼻咽癌骨转移的动物模型较难实现,我们通过肿瘤细胞与组织共培养的模型来模拟器官微环境对肿瘤细胞的影响:组织器官分泌的因子释放至培基中,从而直接作用于肿瘤细胞;而肿瘤细胞所释放的某些因子也将直接作用与组织器官,通过组织器官与肿瘤细胞之间的相互作用,从而影响肿瘤转移的发生发展。本研究通过检测候选鼻咽癌骨转移相关基因在鼻咽癌细胞株5-8F与骨组织共培养前后的表达差异,筛选出5-8F与骨转移相关的基因;再通过5-8F与其他组织（肝、肺、脑）的共培养实验确定其组织特异性。检测方法采用准确性和灵敏性较高的QRT-PCR技术,从而从候选基因中筛选出鼻咽癌骨转移相关基因;进一步通过流式细胞仪、Western Blot以及其他鼻咽癌细胞（C666-1、CNE1、CNE2、6-10B）与骨共培养对筛选出的基因进行验证,初步探讨鼻咽癌骨转移的分子机制,为诊断鼻咽癌骨转移、判断预后以及探索新的治疗策略提供靶标。通过2-ΔΔCT方法和t检验分析荧光实时定量PCR的实验结果,表明在鼻咽癌细胞株中5-8F细胞中,CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1、COX2在与骨组织共培养后的表达上调（P＜0.05）,TGF-β表达下调（P＜0.05）,MMP-1、IL-11、OPN、ITGB3、EZH2、Tiam1、PTHrP、SALP、PLAU、CD44、OPG、Pleiotrophin、ADAMTS1、Erizin表达无差别（P＞0.05）,说明CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1、COX2这五个基因促进5-8F细胞骨转移的发生。为了确定CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1、COX2这五个基因表达上调的骨组织特异性,我们检测了该五种基因在5-8F细胞与不同的鼠组织（肝、肺、脑）共培养前后的表达情况。结果表明:CXCR4、MST1R、COX2三者仅在与骨组织共培养时表达上调,具有骨组织特异性;CTGF在与不同组织共培养时均表达上调,可能是鼻咽癌转移的一个普遍因素。因此,CXCR4、MST1R、COX2可能成为判断鼻咽癌骨转移的标志物。通过流式细胞仪、WesternBlot以及其他鼻咽癌细胞（C666-1、CNE1、CNE2、6-10B）与骨共培养,可以进一步证实CXCR4、MST1R、COX2与鼻咽癌骨转移的相关性,这些结果对临床有一定参考价值,当然也还有待更多的临床验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 缩写词简表
• 骨转移相关因子综述
• 致谢
• 硕士期间发表论文