肿瘤细胞与正常细胞对TRAIL凋亡耐受的机制研究

论文摘要

TNF相关的凋亡诱导配体（"NF-related apoptosis inducing-ligand, TRAIL）是TNF超家族的新成员,它能诱导肿瘤和转化细胞凋亡而不伤害正常细胞组织,因此又称为肿瘤凋亡因子。TRAIL在癌症治疗领域中受到极大关注,然而大多数肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡耐受。研究显示不同的肿瘤细胞对TRAIL凋亡产生耐受的原因可能不尽相同,而TRAIL对正常细胞无毒害作用,它的机理是否与肿瘤细胞有所不同,目前尚无相关报道。TRAIL结合到相应的死亡受体上进而募集FADD和procaspase-8/-10促进DISC形成,DISC 上 procaspase-8/-10二聚化并自切割活化引发caspase级联活化,导致癌细胞的凋亡。TRAIL诱导的凋亡不依赖于p53的状态,不同于放疗和化疗诱导凋亡的机制,后两者主要涉及Bcl-2家族参与的线粒体途径的凋亡。因此,调节DISC水平上起始caspases的活化及执行caspases的活化可能是癌细胞TRAIL凋亡耐受的关键。c-FLIP 与 procaspase-8/-10含有类似的DED结构域,可通过竞争性结合到FADD的DED结构域上,抑制P rocaspase-8/10的活化及随后的凋亡。高水平的凋亡抑制蛋白IAPs直接结合并抑制caspase-3/-7/-9的活化进而导致癌细胞凋亡耐受。本课题首先对TRAIL对不同肿瘤细胞和正常细胞诱导凋亡的耐受机制进行基础性研究。以c-FLIP抑制剂Rocaglamide和IAPs泛拮抗剂AT 406联合活性的rhTRAIL蛋白处理不同的肿瘤细胞和正常细胞,并通过MTT法检测细胞的存活情况,初步了解各细胞可能的耐受原因。结果显示c-FLIP和IAPs是肿瘤细胞对TRAIL耐受的重要原因,其中相对敏感的HCT 116与相对耐受的U2-OS和SK-OV-3细胞在加入两种蛋白的抑制剂或拮抗剂后显示出对TRAIL更为敏感。而原代培养的正常细胞则无明显变化,排除c-FLIP和IAPs对TRAIL诱导正常细胞凋亡耐受的可能原因。此外,在人永生化的正常细胞明显对c-FLIP抑制剂诱导50%的死亡率及加强TRAIL的凋亡效应,暗示着原代的正常细胞和永生化的正常细胞有着不同的耐受机制。其次根据其中一种抑制蛋白c-FLIPs建立一个高通量抗癌特异药筛选的细胞模型。实际是基于TRAIL信号刺激下,c-FLIP 与 procaspase-8/-10竞争性结合到FADD上的蛋白-蛋白之间的相互作用来实现新药发现。具体通过PCR获取c-FLIPs全段序列后双酶切,将c-FLIPs插入到真核表达载体pEGFP-N2中,脂质体转染法使融合有荧光标记的c-FLIPs稳定表达于U2-OS中。通过采集细胞荧光成像,分析TRAIL给药前后的荧光分布变化,将能筛选具有死亡受体激动剂、调节剂或拮抗剂及c-FLIP拮抗剂的化合物。实验结果显示作为对照的空载体转染到U2-OS中,荧光分布在整个细胞,细胞正常分裂生长。而c-FLIPs-pEGFP-N2转染到细胞中,在没有死亡信号刺激下,荧光便发生聚集,培养数日细胞不能正常分裂生长甚至出现细胞死亡。对这些细胞不处理或处理以不同浓度的坏死抑制剂Necrostatin-1,培养数日后细胞仍然不能存活,荧光也随着培养时间的增加而减少直至不见。转染空载体的细胞能正常生长,说明载体及转染试剂对细胞基本无毒。c-FLIPs过量表达可能参与U2-OS细胞中的不利信号导致细胞死亡,具体机制原因还有待进一步研究。本课题通过研究肿瘤细胞和正常细胞对T RAIL凋亡耐受的机制,发现正常细胞和肿瘤细胞耐受机制并不相同。以对肿瘤细胞TRAIL凋亡耐受的蛋白如c-FLIP或IAPs为靶点治疗癌症,将是特异性治疗癌症的理想策略。本课题以研究较少的c-FLIP拮抗剂为重点,建立c-FLIP s特异抗癌药筛选模型,为解决肿瘤细胞对TRAIL的耐药性奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略表
• 第一章 绪言
• 1.1 TRAIL凋亡耐受关键蛋白：c-FLIP
• 1.2 c-FLIP结构
• 1.3 c-FLIP表达调控及降解
• 1.3.1 c-FLIP的转录翻译调控
• 1.3.2 c-FLIP的翻译后修饰及降解
• 1.4 c-FLIP与细胞死亡信号
• 1.4.1 c-FLIP与凋亡
• 1.4.2 c-FLIP与坏死
• 1.4.3 c-FLIP与自噬
• 1.5 c-FLIP与细胞存活信号
• 1.5.1 c-FLIP活化NF-κB信号
• 1.5.2 c-FLIP与MAPK信号
• 1.5.3 c-FLIP与Wnt信号
• 1.6 c-FLIP与胚胎发育及机体病变
• 1.7 c-FLIP与癌症治疗
• 1.8 研究目的及意义
• 第二章 TRAIL诱导细胞凋亡的耐受性机制研究
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 主要溶液及配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 肿瘤细胞系的培养与原代细胞的培养
• 2.3.2 MTT检测法
• 2.3.3 制备细胞裂解液
• 2.3.4 蛋白定量及样品准备
• 2.3.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.3.6 免疫印迹
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 单独给药不同细胞株的生长抑制
• 2.4.2 TRAIL联合Roc与AT 406给药不同细胞株的生长抑制
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• s-EGFP表达载体的构建'>第三章 稳定表达c-FLIP_s-EGFP表达载体的构建
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 主要溶液及配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 目的序列c-FLIPs的获取
• s-EGFP真核表达载体的构建'>3.3.2 c-FLIP_s-EGFP真核表达载体的构建
• s-EGFP的真核细胞转染'>3.3.3 c-FLIP_s-EGFP的真核细胞转染
• 3.4 实验结果
• s序列扩增'>3.4.1 c-FLIP_s序列扩增
• s-pEGFP-N2/DH5α'>3.4.2 菌落PCR鉴定c-FLIP_s-pEGFP-N2/DH5α
• 3.4.3 测序结果
• s和pEGFP-N2酶切鉴定'>3.4.4 重组质粒c-FLIP_s和pEGFP-N2酶切鉴定
• 3.4.5 确定G418的最佳筛选浓度
• 3.4.6 确定DNA/转染试剂比例
• 3.4.7 转染细胞的筛选
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A