农杆菌介导水稻RdreB1BI基因转化草莓的研究

论文摘要

草莓（Fragaria ananassa Duch）属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,是一种重要的经济浆果,在世界范围内广泛种植。然而草莓安全越冬和耐寒品种的缺乏成为生产上的突出问题。生物技术的飞速发展为解决这一问题提供了新的途径。水稻转录因子RdreB1BI是一个调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子。已有研究证明将RdreB1BI基因转化拟南芥,拟南芥植株的抗早性和耐寒性有很大提高。到目前为止还未见有RdreB1BI基因转化草莓的研究。因此本试验目的是用根癌农杆菌介导的转化方法将水稻RdreB1BI基因导入草莓细胞,获得抗寒的转基因植株。主要研究结果有以下几点:1.以草莓‘丰香’、‘雪蜜’、‘鬼怒甘’的叶片和叶柄为外植体,建立了高效离体再生体系。‘丰香’叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）+2,4-D（0.1mg/L）和MS+B5+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）+2,4-D（0.1mg/L）。‘雪蜜’叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+TDZ（1.5mg/L）+IBA（0.2mg/L）和MS+B5+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）。‘鬼怒甘’叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+BA（2.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）和MS+BA（2.0mg/L）+IBA（0.1mg/L）;‘丰香’、‘雪蜜’暗培养时间为14天,‘鬼怒甘’暗培养时间为7天;‘丰香’、‘鬼怒甘’叶片不定芽再生的最佳叶龄为10-30天,‘雪蜜’叶片不定芽再生的最佳叶龄为20天以下。三个草莓品种叶柄不定芽再生的最佳叶龄都是20天以下;叶片放置方式对三个草莓品种的叶片不定芽再生没有影响,叶柄刻伤向上放置有利于三个草莓品种叶柄不定芽再生。2.克隆了rd29A启动子,通过对比分析,与已公布的序列有98.72%的同源性,主要调控区域也一致。构建了两个植物表达载体pYH4215-rd29A和pYF7713-Rdre。3.通过研究影响遗传转化的因素,建立了农杆菌介导的‘雪蜜’草莓遗传转化体系:菌液浓度为OD600=0.4;侵染时间为9min;选用200mg/L的Cb作为抑菌抗生素,20mg/L的Kan作为筛选抗生素;共培养时间3天;共培养培养基:MS+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2 mg/L）;筛选培养基:MS+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）+Kan（20mg/L）+Cb（200mg/L）;伸长培养基:MS+6-BA（0.5mg/L）+NAA（0.1mg/L）+Kan（20mg/L）+Cb（200mg/L）;生根培养基:MS+IBA（0.1mg/L）+Kan（20mg/L）+Cb（200mg/L）。4.获得了Kan抗性的含有RdreB1BI基因的草莓转基因株系15株,PCR以及RT-PCR检测证明,有4个株系外源基因已经成功的导入和整合到草莓基因组中。脯氨酸含量的测定和低温处理表明,转基因的植株较非转基因植株抗寒性有所提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 植物抗寒生理及其分子基础
• 1.1 冷诱导基因
• 1.1.1 与抗冰冻脱水有关
• 1.1.2 与膜脂相变有关
• 1.1.3 与酶有关的低温保护活性
• 1.1.4 抗冻活性
• 1.2 冷诱导基因的表达调控
• 1.3 冷诱导基因遗传转化研究
• 2 DREB类转录因子研究进展
• 2.1 DREB类转录因子
• 2.2 DREB的结构特点和功能
• 2.3 DREB转录因子的表达调控
• 2.4 DREB转录因子的克隆与鉴定
• 3 果树基因工程研究进展
• 3.1 我国果树转基因研究现状
• 3.1.1 果树重要目的基因的克隆研究
• 3.1.2 果树离体再生与遗传转化体系的构建研究
• 3.1.3 目前获得的转基因果树
• 3.2 国内外果树遗传转化研究的比较
• 3.2.1 国内外研究的热点
• 3.2.2 发达国家日益重视的方向
• 3.2.3 我国果树转基因育种研究的重要方向
• 3.3 问题与展望
• 4 草莓基因转化研究进展
• 4.1 草莓遗传转化体系的建立
• 4.2 外源基因转入草莓的研究
• 4.2.1 抗虫害转基因研究
• 4.2.2 抗病毒和抗真菌转基因研究
• 4.2.3 抗逆性转基因研究
• 4.2.4 抗除草剂转基因研究
• 4.2.5 提高草毒品质转基因研究
• 4.3 影响草莓遗传转化的主要因素
• 4.3.1 基因型
• 4.3.2 菌株
• 4.3.3 侵染时间和侵染浓度
• 4.3.4 共培养
• 4.3.5 酚类物质
• 4.3.6 抗生素
• 4.4 问题与展望
• 4.4.1 进一步完善草莓的遗传转化方法
• 4.4.2 优化草莓遗传转化条件,提高基因转移频率
• 4.4.3 从细胞学及分子水平上加强草莓转基因植株的遗传变异分析
• 4.4.4 构建转基因草莓的遗传图谱
• 4.4.5 开发野生草莓及其它野生植物种质中所蕴藏的优良基因资源
• 4.4.6 以草莓为植物反应器生产外源蛋白
• 4.4.7 借鉴共抑制在矮牵牛上的应用改良草莓品种
• 第二章 三个草莓品种高效离体再生体系的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 丰香和雪蜜无菌苗的获得
• 1.1.2 鬼怒甘无菌苗的获得
• 1.2 方法
• 1.2.1 不定芽诱导
• 1.2.2 不定芽生长
• 1.2.3 不定芽生根
• 1.3 培养条件以及培养基中的附加物质
• 1.4 评价指标与数据调查
• 2 结果与分析
• 2.1 不同基本培养基对不定芽再生的影响
• 2.2 暗培养时间对不定芽再生的影响
• 2.3 不同植物生长调节剂组合对不定芽再生的影响
• 2.4 叶龄对不定芽再生的影响
• 2.5 基因型对不定芽再生的影响
• 2.6 叶片以及叶柄放置方式对不定芽再生的影响
• 3 讨论
• 第三章 特异诱导型启动子rd29A的片断克隆及植物表达载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 主要生化试剂
• 1.1.4 PCR引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型幼叶总DNA的提取
• 1.2.2 拟南芥DNA的PCR扩增
• 1.2.3 PCR产物的回收
• 1.2.4 目的片段T载体的连接,转化及鉴定
• 1.2.5 大肠杆菌质粒提取
• 1.2.6 植物表达载体的构建
• 1.2.7 植物表达载体的鉴定
• 1.2.8 质粒转化农杆菌感受肽细胞
• 2 结果与分析
• 2.1 拟南芥DNA的提取
• 2.2 rd29A基因的克隆
• 2.3 植物表达载体的构建以及重组质粒的鉴定
• 2.4 质粒PYH4215—rd29A转化农杆菌感受态EHA105细胞
• 3 讨论
• 第四章 根癌农杆菌介导‘雪蜜'草莓遗传转化体系的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 转化受体植物材料
• 1.2 供试菌株
• 1.3 培养基以及培养条件
• 1.4 方法
• 1.4.1 外植体
• 1.4.2 卡那霉素和潮霉素选择压的确定
• 1.4.3 抑菌抗生素浓度的选择
• 1.4.4 菌液的制备
• 1.4.5 菌液浓度、侵染时间、共培养时间的优化选择
• 1.4.6 GUS瞬间表达
• 1.4.7 草莓的遗传转化步骤
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素和潮霉素选择压对草莓转化的影响
• 2.2 抗生素浓度对草莓转化的影响
• 2.3 菌液浓度、侵染时间、共培养时间的选择
• 2.4 抗性芽的伸长,生根
• 3 讨论
• 第五章 转RdreB1BI基因草莓植株的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 GUS染色
• 1.2.2 PCR扩增检测
• 1.2.3 RT-PCR检测
• 1.2.4 脯氨酸含量测定
• 1.2.5 低温处理
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因植株的GUS组织化学染色检测
• 2.2 转基因草莓植株的PCR检测
• 2.3 转基因植株的RT-PCR检测
• 2.4 脯氨酸含量测定
• 2.5 低温处理
• 3 讨论
• 全文结论以及后续研究
• 1 全文结论
• 2 后续研究
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间所发表论文
• 致谢