论文题目: D-泛解酸内酯水解酶cDNA的克隆、表达与酶的定向进化
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 柳志强
导师: 孙志浩
关键词: 串珠镰孢霉菌,泛解酸内酯水解酶,克隆,表达,分泌,大肠杆菌,酿酒酵母,易错,改组,定向进化,筛选
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 来源于串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536的D-泛解酸内酯水解酶具有高度的立体选择性,可立体专一性拆分DL-泛解酸内酯,生成D-泛解酸。该酶已经成功的应用于工业化,取得了很好的综合效益。为了提高D-泛解酸内酯水解酶的酶活力及在低pH条件下的稳定性,我们在基因水平上对酶进行了研究。利用RT-PCR方法,扩增得到了编码源于串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536的D-泛解酸内酯水解酶cDNA,对其结构进行分析,根据分析结果设计了一对特异引物,成功扩增到了编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA的结构基因,结构基因同pMD18-T载体连接后,进行测序。D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因序列已在Genebank数据库申请登记,登记号为AY728018。将D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因分别插入到大肠杆菌胞内表达载体pTrc99a和分泌表达载体pET20b中,构建重组质粒pTrc99a-LAC和pET20b-LAC。将重组载体pTrc99a-LAC转化大肠杆菌JM109。重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组酶,经SDS-PAGE检测,重组大肠杆菌有分子量约为40 kD的蛋白表达带,重组酶活力平均为39 U/克湿细胞。将分泌重组载体pET20b-LAC转化大肠杆菌BLR(DE3)pLysS,利用IPTG对重组菌进行诱导,D-泛解酸内酯水解酶被分泌表达至大肠杆菌的周质空间,信号肽被正确识别切下后,获得活性的D-泛解酸内酯水解酶,经测定酶活力平均为42 U/克湿细胞。同胞内表达相比,分泌表达酶活力没有明显提高。将D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因同真核表达载体pYX212连接,构建真核表达载体pYX212-LAC。重组表达载体pYX212-LAC电转化尿嘧啶营养缺陷型实验室
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
第一章 序论
1.1 D-泛解酸内酯水解酶
1.1.1 D-泛解酸内酯水解酶的来源及研究概况
1.1.2 D-泛解酸内酯水解酶的实际应用
1.2 D-泛酸简介
1.2.1 D-泛酸用途及市场概况
1.2.2 国内外D-泛酸生产技术发展概况和发展趋势
1.3 酶的定向进化简述
1.3.1 酶的定向进化的产生及定义
1.3.2 定向进化的原理及目的
1.3.3 酶定向进化中的有关问题
1.3.4 定向进化中突变文库的构建方法
1.3.5 定向进化的辅助方法
1.3.6 突变库的质量
1.3.7 突变基因表达系统的构建与选择
1.3.8 突变基因文库的筛选
1.3.9 定向进化的发展概况
1.3.10 生物催化剂的组合改造
1.3.11 定向进化的应用
1.3.12 定向进化展望
1.4 论文研究的目的意义与主要研究内容
第二章 D-泛解酸内酯水解酶cDNA 的克隆及序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 试验方法
2.2 结果
2.2.1 RNA 的提取
2.2.2 反转录及PCR 扩增
2.2.3 PCR 产物克隆
2.2.4 cDNA 结构基因的扩增
2.3 讨论
2.4 本章小结
第三章 D-泛解酸内酯水解酶cDNA在大肠杆菌中的表达
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 试验方法
3.2 结果
3.2.1 表达载体的构建
3.2.2 SDS-PAGE 检测
3.2.3 大肠杆菌分泌表达载体的构建
3.2.4 分泌型表达载体的鉴定
3.2.5 酶活测定
3.3 讨论
3.4 本章小结
第四章 D-泛解酸内酯水解酶cDNA在酿酒酵母中的表达
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 试验方法
4.2 结果与讨论
4.2.1 串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因酵母表达载体的构建
4.2.2 表达载体pYX212-LAC的酶切鉴定
4.2.3 酿酒酵母阳性转化子的PCR 鉴定
4.2.4 串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶cDNA 结构基因在酿酒酵母W303-1A 中的表达及重组子D-泛解酸内酯水解酶酶活测定
4.3 本章小结
第五章 D-泛解酸内酯水解酶的定向进化
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 试验方法
5.2 结果
5.2.1 基因随机突变引入策略
5.2.2 D-泛解酸内酯水解酶筛选模型的建立
5.2.3 突变体的筛选
5.2.4 突变体PCR 鉴定结果
5.2.5 进化酶与野生型酶最适pH 的测定及酶活力对比
5.2.6 进化酶与野生型酶pH 耐受性实验
5.2.7 突变体菌株生长曲线的测定
5.2.8 进化酶与野生型酶序列比较结果
5.2.9 野生型D-泛解酸内酯水解酶与进化酶二级结构预测与对比
5.3 讨论
5.3.1 D-泛解酸内酯水解酶进化策略
5.3.2 突变库的构建与筛选
5.3.3 培养温度及诱导对突变体筛选的影响
5.3.4 突变体酶活及pH 稳定性提高机理的初步探讨
5.4 本章小结
参考文献
论文主要结论
论文的创新之处及理论和实际应用意义
致谢
博士在读期间已发表(含待发表)论文
论文创新点
附图
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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