高成脂能力脂肪干细胞系的分离与纯化

论文摘要

研究背景:脂肪组织是修复全身各部位软组织缺损的最佳选择。临床上自体成熟脂肪组织的移植,不论是脂肪块或是脂肪颗粒的注射移植,均可能出现坏死、再吸收等问题,导致术后长期效果不佳。组织工程技术的出现,对组织器官的修复与替代治疗产生了重大意义。组织工程技术的首要条件就是种子细胞。由于胚胎干细胞受到伦理学和来源的限制,故目前使用最多的种子细胞即成体干细胞。作为种子细胞的成体干细胞主要有两种来源,一是骨髓来源的骨髓干细胞（bone marrow-derived stemcells,BMSCs）,另一种是脂肪组织来源的脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）。相对与BMSCs而言,ASCs取材容易,且细胞量足以满足组织工程的需求,具有很大的优势。但现有的研究表明,通过普通的酶消化法分离出来的ASCs是由极其复杂的各种细胞集合而成,成脂等各项诱导分化的能力及效率都不高。将ASCs进行成脂诱导后两周,其分化比例只为30%～40%,同时ASCs其余的各项分化效率也低于BMSCs。因此,纯化ASCs,提高其诱导分化效率,是优化其成为最佳种子细胞来源之一的有效方法。近年来,有研究发现,成熟脂肪细胞在某种环境中,可去分化回成纤维样细胞状态,这种退回到原始状态的去分化细胞具有多向分化的潜能,且成脂分化能力要高于ASCs。然而这种去分化细胞的高成脂能力是否伴随着某些表面标志的表达,国内外均未见报道。所以,本实验欲比较去分化脂肪细胞与ASCs在表面标志等各方面的不同,寻求出高成脂细胞高表达的表面标志,并希望能通过免疫磁珠分选,提纯出高成脂系ASCs。目的:探索寻求与高成脂能力相关的干细胞表面分子,并通过分选,纯化得到高成脂系ASCs,从而为提高脂肪组织工程的效率提供有效途径。方法:1、从人脂肪组织中分离培养ASCs,成脂诱导分化ASCs,得到诱导后脂肪细胞。收集诱导后漂浮于培养基中的脂肪细胞,天花板贴壁培养10d,脂肪细胞贴壁后翻转正常培养得到去分化脂肪细胞。选择同等代数两种细胞,成脂诱导分化并用油红O染色法鉴定其分化效率;细胞计数法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测定细胞的表面标志表达,并在上述三方面对ASCs和去分化脂肪细胞进行比较,筛选出可能与高成脂能力相关的表面分子。2、就筛选出的可能与高成脂能力相关的表面分子,用免疫磁珠分选法分别分选脂肪组织新鲜分离的间质血管碎片（stromal vascular fractions,SVF）及培养后ASCs。流式细胞检测分选前后细胞群体该表面分子阳性表达率;并对两种分选出的细胞与未行分选的ASCs进行成脂、成骨诱导,油红O染色鉴定成脂诱导结果,茜素红染色鉴定成骨诱导结果。结果:从吸脂术中获得人脂肪组织,培养出ASCs。选择第4代ASCs进行成脂诱导,诱导13d起,收集诱导成熟的脂肪细胞,天花板贴壁培养。培养过程中,多房的脂肪细胞贴壁并逐渐吐出脂泡,最终去分化为成纤维状细胞。去分化细胞与ASCs相比,生长曲线较一致说明两者具有相似的增殖能力;油红O染色鉴定成脂诱导结果表明去分化细胞的成脂分化效率高出ASCs约50%。两种细胞在表面标志的表达上,CD34、CD54的表达阳性率有所差别:去分化细胞的CD34、CD54的表达为阳性,而ASCs的表达均为阴性。用CD54-PE免疫磁珠分选新鲜分离的SVF及经过培养后的ASCs。分选前,流式检测一至三代ASCs,细胞CD54的表达率随着代数的增加而降低。分选后,CD54的表达率在两种细胞群体中均达到90%以上。继续培养数代后,从培养后ASCs分离出的CD54阳性细胞群体CD54表达率维持高水平,新鲜分离SVF中分离出的阳性细胞CD54的表达则降至阴性,未分选的ASCs为阴性表达。分选后的细胞与未分选的ASCs成脂能力比较:从培养后的ASCs分离出的CD54阳性细胞成脂分化率接近100%,未分选的ASCs成脂能力约为30%,而从新鲜分离的SVF中分选出的CD54阳性细胞成脂分化率只为10%左右。成骨诱导结果:ASCs成骨能力为三种细胞中最佳,而从SVF分选出的CD54阳性细胞群的成骨效率最差。结论1、本实验通过比较去分化细胞与ASCs在增殖能力、成脂分化能力与表面标志表达等方面的差别,认为去分化细胞是一种类似于干细胞但较干细胞具有更高成脂分化能力的细胞。去分化细胞CD54、CD34的表达高于ASCs表明CD54、CD34的表达可能与高成脂能力相关。2、CD54免疫磁珠分选经过培养的ASCs,能纯化ASCs并分离出高成脂系干细胞。因而,CD54应是高成脂系干细胞特异表达的表面分子之一,从ASCs分离CD54阳性细胞可做为纯化高成脂干细胞系的方法之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 脂肪干细胞及去分化脂肪细胞的培养和细胞生物学比较
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• +脂肪干细胞的实验研究'>第二章 免疫磁珠分选CD54⁺脂肪干细胞的实验研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 参考文献
• 综述
• 中英文缩略词对照表
• 攻读学位期间的成果
• 致谢