不同方法的固定化脂肪酶在天然VE提纯的酶法预处理中的酯化性能

论文摘要

脂肪酶催化大豆油脱臭馏出物中游离脂肪酸进行酯化,转化为脂肪酸甲酯,降低其沸点有利于天然维生素E的提纯,且反应条件温和,能较好地保持天然VE的活性。高酯化性能、低水解性能的固定化脂肪酶能够连续利用、稳定性好,更利于工业化生产。本文首先利用物理吸附法、共价/交联结合法、包埋法和离子交换吸附法四种方法,对假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase)进行固定化,通过实验考查,离子交换吸附法中214型树脂是最适固定化载体。通过单因素实验和曲面响应法研究,得到了214型树脂固定化的最佳条件：酶浓度6.09 mg/ml,缓冲液pH 8.40、振荡转速为134.26rpm/min、固定化温度为30.0℃、固定化时间4.0 h、树脂的量0.75 g,固定化酶酶结合量为11.03 mg/g树脂,甲醇相对酯化率为28.94%,与预测值吻合良好。在不加甲醇的情况下,固定化酶也能催化游离脂肪酸与甾醇酯化(游离酶在不加甲醇时表现为水解性能)。其次对214型树脂固定化酶进行了催化性能研究。从表观酶活力来看,固定化酶的酶活力为1147.22±5.20 U/g树脂,与Novozym 435相差不大；与离心后的假丝酵母脂肪酶相比,酶活力提高了26.31倍。固定化酶不能催化棕榈油水解,能够催化多种醇类酯化。固定化酶的最适pH值为8.4,并且适宜pH范围扩大；最适温度较游离酶明显拓宽；热稳定性与贮存稳定性均有明显改善；固定化酶以硬脂酸为底物时的表观米氏常数Km为0.480g/l(软脂酸,0.461g/l),游离酶的Km为0.456g/l(软脂酸,0.175g/l),说明假丝酵母脂肪酶经固定化后,表观米氏常数增大,酶与底物的亲和力降低了；固定化酶催化硬脂酸与丙三醇酯化时,重复4次后酶活保留达55.4%。最后利用聚丙烯酸模拟树脂对脂肪酶进行固定化,探索树脂固定化酶的固定化机理。通过对红外光谱的分析,我们初步推测出聚丙烯酸与脂肪酶在固定化过程中发生了离子交换反应,与离子交换树脂固定化脂肪酶的理论相吻合,即树脂上游离的羧基与脂肪酶的氨基发生离子交换作用。在树脂对脂肪酶进行固定化时,pH不但决定树脂交换基团的容量,同时对酶固定化后酯化活性有较大影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 天然VE提纯的酶法预处理技术
• 1.1.1 VE的结构和基本性质
• 1.1.2 VE的生理作用及应用
• 1.1.3 天然VE的来源
• 1.1.4 天然VE提纯的酶法预处理及评价
• 1.2 脂肪酶的固定化
• 1.2.1 脂肪酶的概述
• 1.2.2 假丝酵母脂肪酶的结构和催化机理
• 1.2.3 游离酶的缺点
• 1.2.4 固定化酶的提出及优点
• 1.2.5 固定化方法
• 1.2.6 脂肪酶固定化的载体
• 1.3 与本课题相关的研究进展
• 1.3.1 脂肪酶催化结构的研究
• 1.3.2 固定化酶的研究
• 1.3.3 固定化脂肪酶酶预处理大豆油脱臭馏出物的研究
• 1.4 本论文研究意义和内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 固定化方法的选择
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂与仪器
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 溶液的配制
• 2.3.2 酸值的测定
• 2.3.3 酶液浓度的测定
• 2.3.4 固定化酶的制备
• 2.3.4.1 物理吸附法制备固定化酶
• 2.3.4.2 共价/交联结合法制备壳聚糖凝胶固定化酶
• 2.3.4.3 包埋法制备壳聚糖凝胶固定化酶
• 2.3.4.4 离子交换吸附法制备固定化酶
• 2.3.5 固定化酶催化大豆油脱臭馏出物脂肪酸甲酯化/水解反应
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酶液浓度的标准曲线
• 2.4.2 物理吸附法制备壳聚糖凝胶固定化酶
• 2.4.2.1 不同酶浓度对固定化酶酯化/水解性能的影响
• 2.4.2.2 不同载体的量对固定化酶酯化/水解性能的影响
• 2.4.2.3 不同吸附时间对固定化酶酯化/水解性能的影响
• 2.4.3 共价/交联结合法制备壳聚糖凝胶固定化酶
• 2.4.3.1 交联剂的选择
• 2.4.3.2 不同戊二醛的量对固定化酶性能的影响
• 2.4.3.3 交联时间对固定化酶性能的影响
• 2.4.3.4 保存时间对固定化酶性能的影响
• 2.4.4 包埋法制备壳聚糖凝胶固定化酶
• 2.4.4.1 不同pH对固定化酶性能的影响
• 2.4.4.2 不同TPP的量对固定化酶性能的影响
• 2.4.4.3 不同酶量对固定化酶性能的影响
• 2.4.4.4 不同壳聚糖浓度对固定化酶性能的影响
• 2.4.4.5 二次调节pH对固定化酶性能的影响
• 2.4.5 离子交换吸附法制备固定化酶
• 2.4.5.1 单因素试验
• 2.4.5.1.1 树脂种类的选择
• 2.4.5.1.2 酶液浓度对催化性能的影响
• 2.4.5.1.3 树脂的量对催化性能的影响
• 2.4.5.1.4 酶液pH对催化性能的影响
• 2.4.5.1.5 吸附时间对催化性能的影响
• 2.4.5.1.6 振荡转速对催化性能的影响
• 2.4.5.1.7 振荡温度对催化性能的影响
• 2.4.5.1.8 多次固定化对酶结合率的影响
• 2.4.5.2 Plackett-Burman试验设计及结果
• 2.4.5.3 Box-Behnken试验设计及结果分析
• 2.4.5.3.1 模型方程的建立与显著性检验
• 2.4.5.3.2 固定化酶的响应面分析
• 2.4.5.3.3 模型验证实验
• 2.5 本章小结
• 第三章 树脂固定化酶的催化性能研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验试剂与仪器
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 溶液的配制
• 3.3.2 酸值的测定
• 3.3.3 反应过程
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 固定化酶的酶活
• 3.4.2 利用棕榈油测定固定化酶水解效果
• 3.4.3 有机溶剂的选择
• 3.4.4 固定化酶对不同羟基供体催化酯化的效果
• 3.4.5 固定化酶的最适反应pH
• 3.4.6 固定化酶的最适反应温度
• 3.4.7 固定化酶的米氏方程
• 3.4.8 固定化酶的稳定性
• 3.5 本章小结
• 第四章 离子交换树脂固定化脂肪酶的机理探索
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 脂肪酶固定化的机理探索
• 4.2.2 pH对固定化脂肪酶催化活性影响的探索
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 脂肪酶固定化的机理探索
• 4.3.2 pH对固定化脂肪酶催化活性影响的探索
• 4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文