Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光新体系的研究及其在磁酶免疫分析中的应用

论文摘要

化学发光分析法由于仪器设备简单,分析速度快,灵敏度高,线性范围宽等优点,越来越受到科研工作者的广泛关注。本工作研究了新型增强剂溴酚兰（BPB）对Luminol-H2O2-HRP化学发光反应的增强作用,提出了Luminol-H2O2-HRP-BPB化学发光新体系。在最佳实验条件下,分别测定了游离HRP和HRP标记物的线性范围及检测限。将此化学发光增强体系与磁性分离技术和酶联免疫分析相结合,对癌胚抗原（CEA）、甲状腺素（T4）等肿瘤标记物进行了测定。此外,采用纳米金作为酶标抗体标记物,利用化学发光增强体系对甲胎蛋白（AFP）进行检测。结果表明,该方法灵敏度高,分析快速、简便,在生物分析中具有广阔的应用前景。本文主要开展了以下几个方面的工作:一、Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光新体系的研究研究了Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光反应体系的增强作用。在最佳实验条件下,对游离HRP进行了测定,测定游离HRP的线性范围为1.0×10-11～5.0×10-10 g/mL,检测限为1.25×10-12 g/mL;并对HRP标记物进行了测定,检测限比Luminol-H2O2-HRP直接化学发光体系低1000倍,比四甲基联苯胺ELISA显色法低10倍。并对Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光体系机理进行了初步探讨。二、基于Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光磁酶免疫体系测定CEA和T4采用羧基修饰的磁性微球,经EDC/NHS活化处理后得到活化磁性微球,将AFP单克隆抗体固定于活化磁性微球表面,所制备的免疫磁性微球具有识别和捕获相应抗原的能力。将磁珠分离技术与Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光体系相结合,分别对癌胚抗原（CEA）和血清总甲状腺素（T4）进行了测定。采用双抗体夹心法对CEA进行了测定,测得CEA的线性范围为1.0～40.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL,比四甲基联苯胺ELISA显色光度法低5倍;采用竞争法对T4进行了测定,测得T4的线性范围为1.0～30.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL,比四甲基联苯胺ELISA光度法低5倍。该方法操作简单、快速,用所建立的方法对病人血清样品进行了测定,并与酶联免疫吸附测定光度法（ELISA）进行了对照,二者相关性良好。三、基于纳米粒子标记的Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光磁免疫体系测定AFP采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金粒子,通过控制还原剂柠檬酸三钠的加入量,制得不同粒径的纳米金粒子。通过静电作用将HRP标记的甲胎蛋白（AFP）抗体连接到纳米金粒子上。利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱分析确定纳米金粒子与抗体连接时所需抗体的最佳浓度为0.6μg/mL。以纳米金作为酶标记物,将磁分离技术与Luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光体系相结合,采用双抗体夹心法,对AFP进行了测定,并与直接加入酶标抗体的方法相比较。酶标抗体标记方法测定AFP的线性范围为1.0～50.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL;纳米金作为酶标抗体标记物测定AFP的线性范围为0.1～50.0 ng/mL,检测限为0.1 ng/mL,比四甲基联苯胺ELISA显色光度法低50倍。用所建立的方法对病人血清样品进行了测定,并与酶联免疫吸附测定光度法（ELISA）进行了对照,相关性良好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 化学发光免疫分析基本原理
• 1.1 化学发光基本原理
• 1.2 免疫分析基本原理
• 1.2.1 非标记免疫分析法
• 1.2.2 标记免疫分析法
• 1.2.3 非均相免疫分析法
• 1.2.4 均相免疫分析法
• 1.3 化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA）基本原理
• 1.3.1 固相化学发光免疫分析基本原理
• 1.3.1.1 直接法
• 1.3.1.2 间接法
• 1.3.1.3 双抗体夹心法
• 1.3.1.4 双夹心法
• 1.3.1.5 竞争法
• 1.3.2 均相化学发光免疫分析基本原理
• 2 化学发光免疫分析主要类型
• 2.1 化学发光免疫分析
• 2.1.1 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物标记的化学发光免疫分析
• 2.1.2 吖啶酯化合物标记的化学发光免疫分析
• 2.2 化学发光酶免疫分析
• 2.2.1 HRP 标记的CLEIA
• 2.2.2 ALP 标记的CLEIA
• 2.3 电化学发光免疫分析
• 3 化学发光免疫分析的现状及发展趋势
• 3.1 流动注射化学发光免疫分析（FI-CLIA）
• 3.2 毛细管电泳化学发光免疫分析（CE-CLIA）
• 3.3 高效液相色谱化学发光免疫分析法（HPLC-CLIA）
• 3.4 微流控芯片化学发光免疫分析
• 3.5 免疫磁性微球技术的性质及其应用
• 3.5.1 免疫磁性微球的性质
• 3.5.2 免疫磁性微球技术的基本原理
• 3.5.3 免疫磁性微球技术的应用
• 3.5.3.1 免疫检测
• 3.5.3.2 细胞分离
• 3.5.3.3 生物大分子纯化
• 3.5.3.4 分子生物学的应用
• 3.5.3.5 细菌分离的应用
• 3.6 纳米金粒子在免疫分析中的应用
• 3.6.1 纳米金粒子的制备
• 3.6.1.1 反相胶束法
• 3.6.1.2 水相合成法
• 3.6.2 纳米金粒子与抗体的连接
• 3.6.2.1 静电作用连接
• 3.6.2.2 Au-S 共价键连接
• 4 课题意义及主要内容
• 2O₂-HRP化学发光体系的研究'>第二章 溴酚兰增强Luminol-H₂O₂-HRP化学发光体系的研究
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2O₂-HRP–BPB增强化学发光体系的实验方法'>2.2.1 Luminol-H₂O₂-HRP–BPB增强化学发光体系的实验方法
• 2.2.2 HRP 标记物的测定
• 2O₂-HRP直接化学发光测定方法'>2.2.3 Luminol-H₂O₂-HRP直接化学发光测定方法
• 3 结果与讨论
• 2O₂-HRP -BPB增强化学发光体系的动力学曲线'>3.1 Luminol-H₂O₂-HRP -BPB增强化学发光体系的动力学曲线
• 3.2 化学发光最佳条件的选择
• 3.2.1 Luminol 溶液pH 值对化学发光强度的影响
• 2O₂-HRP-BPB混合溶液pH值对化学发光强度的影响'>3.2.2 H₂O₂-HRP-BPB混合溶液pH值对化学发光强度的影响
• 2O₂浓度对化学发光的影响'>3.2.3 H₂O₂浓度对化学发光的影响
• 3.2.4 Luminol 溶液浓度对化学发光的影响
• 3.2.5 BPB 溶液浓度对化学发光的影响
• 2O₂-HRP-BPB混合溶液静置时间对化学发光强度的影响'>3.2.6 H₂O₂-HRP-BPB混合溶液静置时间对化学发光强度的影响
• 3.2.7 不同进样方式对化学发光强度的影响
• 3.3 游离HRP 的测定
• 3.4 HRP 标记物的测定
• 2O₂-HRP-BPB增强化学发光体系反应机理的研究'>3.5 Luminol-H₂O₂-HRP-BPB增强化学发光体系反应机理的研究
• 4 小结
• 第三章 免疫磁性微球的制备
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 羧基修饰磁性微球的表征
• 2.2.2 磁性微球的活化
• 2.2.3 磁性微球表面酶标抗体的偶联
• 2.2.4 化学发光检测免疫磁性微球
• 3 结果与讨论
• 3.1 羧基修饰磁性微球的表征
• 3.2 磁性微球的活化与酶标抗体的偶联
• 4 小结
• 2O₂-HRP-BPB增强化学发光磁酶联免疫分析测定癌胚抗原'>第四章 Luminol-H₂O₂-HRP-BPB增强化学发光磁酶联免疫分析测定癌胚抗原
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验原理
• 2.2.2 实验过程
• 2.2.2.1 CEA 单克隆抗体包被磁性微球的制备
• 2.2.2.2 双抗体夹心磁性微球的制备
• 2.2.2.3 化学发光测定CEA
• 2.2.2.4 ELISA 法测定CEA
• 3 结果与讨论
• 3.1
• 3.1.1 CEA 单克隆抗体包被磁性微球的制备条件的选择
• 3.1.2 单克隆抗体与抗原最佳免疫反应时间的选择
• 3.1.3 抗原与酶标抗体最佳免疫反应时间的选择
• 3.2 CEA 的检测
• 3.3 血清样品分析
• 4 小结
• 第五章 增强化学发光磁酶联免疫分析测定血清总甲状腺素
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验原理
• 2.2.2 实验过程
• 4单克隆抗体包被磁性微球的制备'>2.2.2.1 T₄单克隆抗体包被磁性微球的制备
• 2.2.2.2 竞争法制备免疫磁性微球
• 4'>2.2.2.3 化学发光测定T₄
• 4'>2.2.2.4 ELISA法测定测定T₄
• 3 结果与讨论
• 3.1 最佳检测条件
• 4的检测'>3.2 T₄的检测
• 3.3 血清样品分析
• 4 小结
• 第六章 纳米金粒子的制备与标记
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 纳米金粒子的制备
• 2.1.4 纳米金粒子的表征
• 2.1.5 纳米金粒子保存条件的选择
• 2.1.6 纳米金粒子与抗体用量比例的选择
• 2.1.6.1 紫外-可见吸收光谱分析
• 2.1.6.2 荧光光谱分析
• 2.1.7 纳米金粒子和抗体的静电连接
• 3 结果与讨论
• 3.1 紫外-可见吸收光谱分析
• 3.2 透射电子显微镜分析
• 3.3 纳米金粒子保存pH 条件的确定
• 3.4 纳米金粒子与抗体用量比例的选择
• 3.4.1 纳米金粒子标记抗体后的紫外-可见吸收光谱分析
• 3.4.2 纳米金粒子标记抗体后的荧光光谱
• 3.5 纳米金粒子标记抗体的表征
• 4 小结
• 第七章 免疫纳米金粒子在免疫分析中的应用
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验原理
• 2.3 实验过程
• 2.3.1 AFP 单克隆抗体包被磁性微球的制备
• 2.3.2 双抗体夹心磁性微球的制备
• 2.3.3 化学发光测定CEA
• 2.3.4 ELISA 法测定测定AFP
• 3 结果与讨论
• 3.1 最佳检测条件
• 3.2 AFP 的检测
• 3.3 血清样品分析
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录