成年斑马鱼视神经损伤后轴突再生与髓鞘再建的研究

论文摘要

斑马鱼中枢神经系统拥有很强的再生能力,它的视神经在损伤之后能够很快地再生并且恢复视觉功能。然而,这种视觉功能的恢复是否需要视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）的新生还不是很清楚。我们对不同损伤条件下RGC细胞的数目进行了定量统计,结果表明：在视神经夹伤的情况下,几乎所有的RGC都存活；在视神经切断模式中前2周有超过90%的RGC存活,并且在损伤后第7周仍旧有75%的RGC存活。顶盖逆行标记显示了RGC轴突有惊人的再生能力,在视神经夹伤后第1周有90%以上的RGC再生到了顶盖,在切断模型中也有50%以上的RGC再生到了顶盖,切断之后的第4周达到正常的水平。此外,RGC双标与BrdU的结果都显示几乎没有新的RGC产生。因此,我们直接地证明了成年斑马鱼视神经损伤后的视觉功能恢复的主要策略是RGC细胞的存活与轴突的再生。与神经元再生障碍不同的是,中枢神经系统的髓鞘结构可以再建。关于成年动物再髓鞘化的过程,一般认为它是发育过程中髓鞘形成的重演。然而,关于再髓鞘细胞的来源问题,现在了解的还不是很全面,一般认为是少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte precursor cells, OPC）充当了主要的来源,而成熟的少突胶质细胞（oligodendrocyte, OC）则不太可能在这一过程中扮演角色。即使有人在电镜下观察到了成熟的OC可能也具有分裂的能力,但是由于到目前为止还缺乏直接的证据。成年斑马鱼视神经损伤能够造成髓鞘的丢失,之后表现出再髓鞘现象。我们观察到了炎症细胞快速侵入并帮助清理髓鞘片段,但是很少看到OC胞体的消失。相反,我们看到了OC表现出增殖的现象,表达pho-ERK1/2的olig2+细胞数目在损伤远心端明显比近心端要显著提高。我们在活体水平实时动态观察到了移植视神经上具有复杂分支的OC能够以一种非对称的方式产生新的细胞,新产生的细胞类似于前体细胞,具有很强的迁移能力。我们进一步发现炎症反应在一定程度上阻碍了OPC的迁移进入损伤位点。在损伤早期阶段,损伤位点聚集大量的NG2阳性细胞,且该时刻视神经上TNFa水平最高,从而阻止OPC迁移进入损伤位点；而当NG2与TNFa消失之后,OPC开始进入损伤位点并逐渐成熟。我们用结扎的办法延长视神经上炎症的存在时间,发现OPC进入损伤位点的时间与髓鞘恢复的时间都有所延迟。最后,髓鞘再生在损伤后第7周基本完成,虽然髓鞘的厚度没有达到正常水平,但是郎飞氏节的密度并没有降低,视觉功能也在髓鞘再生基本完成的情况下得以恢复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 图表目录
• 縮写
• 第一章 绪论（神经再生与功能恢复）
• 1.1 神经损伤与修复是一个既古老而又新兴的研究方向
• 1.1.1 神经损伤与细胞死亡
• 1.1.1.1 神经元的变化
• 1.1.1.2 髓鞘细胞的变化
• 1.1.1.3 星形胶质细胞的变化
• 1.1.1.4 炎症细胞的变化
• 1.1.2 哺乳类动物中的自发性轴突再生
• 1.1.2.1 自发性轴突再生的发现
• 1.1.2.2 生长锥的形成与再生
• 1.1.2.3 再生轴突的延长方式
• 1.1.2.4 神经再生的方式
• 1.1.3 哺乳动物CNS中存在抑制轴突再生的因素
• 1.1.4 哺乳类神经再生的临床研究
• 1.2 斑马鱼在神经损伤与修复中的应用
• 1.2.1 斑马鱼的背景
• 1.2.2 斑马鱼的视觉通路
• 1.2.2.1 斑马鱼眼球结构
• 1.2.2.2 斑马鱼视神经细胞组成
• 1.2.2.3 斑马鱼的视觉通路
• 1.2.2.4 斑马鱼视觉系统的干细胞特性
• 1.2.3 成年斑马鱼视神经损伤模型
• 1.2.3.1 成年斑马鱼视觉损伤相关的模型
• 1.2.3.2 斑马鱼视神经损伤是一个研究神经再生的完美模型
• 1.2.4 成年斑马鱼视神经再生的时间进程
• 1.2.4.1 第一步—视网膜节细胞感受损伤信号
• 1.2.4.2 第二步—启动轴突再生
• 1.2.4.3 第三步—克服外在环境并再生大量轴突
• 1.2.4.4 第四步—突触精细化与再髓鞘化和功能恢复
• 1.2.5 视网膜节细胞轴突再生的内在因素
• 1.2.5.1 细胞存活相关的胞质蛋白与转录因子
• 1.2.5.2 轴突再生相关的骨架蛋白
• 1.2.5.3 轴突引导相关的膜蛋白
• 1.2.6 视网膜节细胞轴突再生的外在因素
• 1.2.6.1 外在环境缺乏抑制因子
• 1.2.6.2 外在环境中的促进作用
• 1.3 斑马鱼髓鞘发育与髓鞘再建的研究
• 1.3.1 斑马鱼的髓鞘发育
• 1.3.2 再生过程中的髓鞘再建
• 1.4 神经再生与功能评判
• 1.5 斑马鱼的可视化研究
• 1.5.1 活体观察幼年斑马鱼神经发育与轴突再生
• 1.5.2 活体观察幼年斑马鱼髓鞘形成与髓鞘再生
• 1.5.3 成年斑马鱼活体成像
• 1.6 本研究的目的
• 1.7 本研究的创新之处
• 第二章 实验试剂与配方
• 2.1 养鱼常用配方
• 2.2 免疫组化及抗体信息
• 2.3 蛋白免疫印迹相关试剂
• 2.4 活体成像相关试剂
• 2.5 药物干扰相关试剂
• 2.6 显微成像相关参数
• 第三章 成年斑马鱼视网膜内神经元存活及胶质细胞反应
• 摘要
• ABSTRACT
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验动物与品系
• 3.2.2 斑马鱼视神经损伤
• 3.2.3 斑马鱼视网膜节细胞标记
• 3.2.4 斑马鱼眼球内注射药物
• 3.2.5 视动反应检测视觉功能
• 3.2.6 视网膜铺片技术
• 3.2.7 斑马鱼心脏灌流
• 3.2.8 超薄冰冻切片
• 3.2.9 免疫组化
• 3.2.10 蛋白印迹
• 3.2.11 透射电镜
• 3.2.12 数据统计
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 顶盖逆行标记成年斑马鱼视网膜节细胞
• 3.3.2 不同损伤条件下视网膜节细胞的存活
• 3.3.3 不同损伤条件下视网膜节细胞的再生
• 3.3.4 视神经再生早期阶段没有观察到视网膜节细胞的新生
• 3.3.5 成年斑马鱼视网膜内存在少突胶质细胞包裹的髓鞘结构
• 3.3.6 视神经损伤对视网膜内少突胶质细胞的影响
• 3.3.7 视神经损伤后视网膜内炎症反应时程
• 3.3.8 视网膜内炎症反应的两面性
• 3.3.9 视网膜内轴突与髓鞘的完整有利于功能再生
• 3.4 讨论
• 第四章 成年斑马鱼视神经损伤后少突胶质细胞的分裂促进髓鞘再建
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 视神经移植
• 4.2.2 视神经结扎
• 4.2.3 成年斑马鱼视神经活体成像
• 4.2.4 协同眼动检测视觉功能
• 4.2.5 酶联免疫吸附法检测炎症因子
• 4.2.6 细胞凋亡检测
• 4.2.7 透射电镜统计视神经上的髓鞘指数
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 神经损伤引起髓鞘结构的丢失
• 4.3.2 髓鞘的丢失吸引炎症细胞的进入并清理髓鞘片段
• 4.3.3 远心端少突胶质细胞因神经损伤而开始激活
• 4.3.4 活体成像证据表明成熟的少突胶质细胞能够分裂
• 4.3.5 损伤中心区域的胶质疤痕阻止了少突胶质细胞前体细胞进入
• 4.3.6 损伤后期髓鞘再建与功能恢复
• 4.4 讨论
• 4.5 第四章补充材料
• 4.6 总结与展望
• 参考文献
• 附录说明
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与所获奖项
• 个人简历