论文题目: 转人t-PA指形区缺失突变体基因山羊体细胞核移植研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 临床兽医学
作者: 赵晓娥
导师: 张涌
关键词: 山羊,卵母细胞,体外成熟,体外培养,转基因,核移植
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究的目的是通过山羊体细胞核移植、胚胎细胞继代核移植技术生产转人t-PA 指形区缺失突变体基因山羊胚胎,通过荧光和PCR 检测,以期实现在胚胎植入前对外源基因整合表达检测;优化胚胎培养体系,提高转基因核移植胚的囊胚发育率。1. 比较了不同生长因子、季节和OM 液的pH 值对卵母细胞成熟的影响。(1)OM中分别添加10 ng/mL 的EGF,IGF 及EGF+IGF, IGF 组和EGF+IGF 组卵母细胞的成熟率(80.0%和82.4%)高于EGF 组(73.8%),极显著高于对照组(67.3%)。表明EGF 和IGF对山羊卵母细胞的体外成熟有促进作用。(2)比较了季节对卵母细胞体外成熟的影响,结果发现,12 月到次年1 月采集的卵母细胞体外成熟率最高(81.0%);11 月采集的卵母细胞体外成熟率较高(74.1%);3～5 月和9～10 月采集的卵母细胞体外成熟率接近(66.0%和69.6%);6～7 月初采集的卵母细胞体外成熟率最差(55.1%)。(3)当OM 的pH 值为7.2 和6.8～7.0 时,卵母细胞成熟率为66.2%和61.0%,显著高于pH≥7.5 时的成熟率(50.9%)(p<0.05)。表明pH 值为7.2 时卵母细胞体外成熟率最高。2.比较了不同的激活方法对卵母细胞孤雌激活的影响,以及培养液(CR1aa或SOFaa)中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。(1)采用Eth + 6-DMAP 、A23187+6-DMAP和Ion+6-DMAP三种方法激活山羊卵母细胞,Eth + 6-DMAP组孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率(35.2%和4.8%)显著低于A23187+6-DMAP组(68.9%和24.1%)和Ion+6-DMAP组(88.1%和48.0%),表明以Ion+ 6-DMAP激活最为理想。(2)在培养液(CR1aa或SOFaa)与颗粒细胞共培养条件下,分别添加10%的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FBS)和新生牛血清(NCS)。CR1aa组分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚率分别为48.1%和45.0%,显著高于添加NCS组(26.0%)。SOFaa液分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚发育率分别为50.5%和48.7%,显著高于添加NCS组(29.3%)。表明CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜于山羊孤雌胚的体外培养,添加10%的OCS和FBS可显著提高孤雌胚的囊胚发育率。3.改造牛BLG 基因的5′调控序列并克隆在质粒载体pMD-18T,标记为pBLG。利用Xho I 和EcoR I 双酶切pBLG和真核表达载体pEGFP-C1,回收目的片断并连接,得到的质粒标记为pEB,然后用SalI 和BamH I 双酶切质粒pEB 和ptPA,回收目的片断并连接,构建表达载体pBT。4.利用脂质体转染法导入外源基因,转染细胞48 h 后,在荧光显微镜下观察报告基因GFP 表达,发现表达良好。利用G418 进行抗性细胞克隆筛选33 d,细胞经PCR 检
论文目录:
前言
摘要
文献综述
第一章 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展
1.1 胚胎细胞核移植发展简史
1.2 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展
1.2.1 小鼠胚胎细胞核移植研究进展
1.2.2 兔胚胎细胞核移植研究进展
1.2.3 羊胚胎细胞核移植研究进展
1.2.4 猪胚胎细胞核移植研究
1.2.5 牛胚胎细胞核移植研究进展
1.3 影响哺乳动物核移植成功率的因素
1.3.1 卵母细胞去核
1.3.2 胚胎细胞的分离与注入
1.3.3 电融合与电激活
1.3.4 细胞发育阶段
1.3.5 核移植胚胎的体外培养
第二章 哺乳动物体细胞核移植研究进展
2.1 动物克隆的理论基础
2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展
2.2.1 小鼠体细胞核移植研究进展
2.2.2 兔体细胞核移植研究
2.2.3 羊体细胞核移植研究
2.2.4 猪体细胞核移植研究
2.2.5 牛体细胞核移植研究
2.3 影响核移植成功率的因素
2.3.1 供体细胞的选择
2.3.2 供体细胞同步化处理
2.3.3 受体卵母细胞的选择与处理
2.3.4 受体卵母细胞的去核方法
2.3.5 卵母细胞和重组胚的激活
2.3.6 核质互作
2.4 克隆动物存在的问题
2.5 克隆哺乳动物应用前景和展望
2.5.1 在基础科学中的应用
2.5.2 在畜牧业生产和濒危、珍稀动物保护上的应用
2.5.3 生产转基因动物和医学领域中的应用
2.5.4 动物克隆技术的不足及未来发展方向
试验研究
第三章 山羊卵母细胞的体外成熟研究
3.1 材料和方法
3.2 结果
3.3 讨论
3.4 结论
第四章 山羊卵母细胞的孤雌激活研究
4.1 材料和方法
4.2 结果
4.3 讨论
4.4 结论
第五章 转人t-PA 指形区缺失突变体基因乳腺特异表达载体的构建
5.1 材料与方法
5.2 结果与分析
5.3 讨论
第六章 转人t-PA 指形区缺失突变体基因的山羊胎儿成纤维细胞的筛选
6.1 材料与方法
6.2 结果
6.3 讨论
6.4 结论
第七章 山羊卵母细胞的去核研究
7.1 材料和方法
7.2 结果
7.3 讨论
7.4 结论
第八章 转人t-PA 指形区缺失突变体基因山羊的体细胞核移植研究
8.1 材料和方法
8.2 结果
8.3 讨论
8.4 结论
第九章 转基因山羊体细胞核移植胚胎体外培养
9.1 材料和方法
9.2 结果
9.3 讨论
9.4 结论
第十章 山羊转 t-PA 突变体基因的体细胞核移胚的继代克隆
10.1 材料和方法
10.2 结果
10.3 讨论
10.4 结论
总结
参考文献
个人简介
发布时间: 2005-12-22
参考文献
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- [8].猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼.广西大学2008
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