论文摘要
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，可引起各种急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并与肝细胞癌的发生有非常密切的关系。根据HBV基因序列的差异，可将HBV毒株分为不同的基因型，目前已确定有A-H 8个基因型。HBV基因型与其流行特征、致病性、疾病治疗及预后等方面存在十分紧密的关系。不同基因型呈一定的地理区域性分布，我国的主要流行株有B型和C型。而基因型C在全国各地均有流行，尤其以北方地区流行为主，有的城市甚至高达69％。HBV具有高度的宿主特异性，仅感染人和少数灵长类动物，不感染小鼠等常见实验动物，从而使有关HBV及乙型肝炎的研究受到很大限制。转基因小鼠的建立，为乙型肝炎的基础研究和抗乙肝病毒药物的开发带来了希望。但是HBV全基因组单拷贝或二拷贝转基因动物实验显示HBV的复制和表达效率很低，严重影响了其广泛应用。细胞和动物模型均显示1.3倍加长片段可获得HBV的高效复制和表达。但是目前国内多于D型转基因小鼠见多，而针对我国流行株C型转基因小鼠研究较少。因此本课题组在国内率先构建我国流行株C型HBV1.3倍加长片段，并利用显微注射法试图建立一种C型HBV基因高效复制和表达的转基因小鼠，为我国乙型肝炎预防和治疗研究更加理想的动物模型。本研究采用已构建好的含有1.3copy加长HBV片段的质粒pUC19-HBV（C）1.3，酶切鉴定证实质粒构建成功，DNA测序证实插入的目的基因1.3copy HBV与报道一致。取其中1.0copy与报道的C基因型参照序列进行比对，同源性达98％，证实目的基因为C基因型。然后进行质粒的大量提取，SmaⅠ酶切后对照孔胶和回收孔胶同时电泳，对照孔胶进行染色，回收孔胶与之参照即可切下目的片段，4.1kb大小的DNA目的片段HBV（C）1.3经回收纯化，稀释成3ng／μl的注射用DNA溶液。选4-5周龄发育良好的FVB／N母鼠，腹腔注射5IU孕马血清（pregnant mareserum gonadotropin，PMSG），48h后注射5IU人绒毛膜促性腺激素（humanchorionic gonadotropin，HCG），激素超排处理后与FVB／N公鼠1∶1合笼，次日清晨检阴栓阳性为显微注射用受精卵供体鼠。将结扎KM公鼠与正常KM母鼠合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠做为注射后受精卵移植的受体鼠。将HBV（C）1.3DNA溶液利用原核显微注射的方法直接注入超排得到的FVB／N单细胞受精卵的原核内，取注射存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内。待其怀孕产仔后，分别从HBV基因组的整合、复制及表达等方面对仔鼠进行鉴定：①抽提仔鼠鼠尾基因组DNA，采用PCR技术进行外源DNA整合分析，PCR产物经电泳分析鉴定阳性条带。②进行小鼠眼眶后静脉丛采血，取血清进行血清HBsAg和HBeAgELISA检测和HBV DNA定量PCR检测，以检测HBV DNA在血清的表达和复制情况。③取肝脏组织制作切片，以抗HBs和抗HBc进行肝脏组织HBsAg和HBcAg的免疫组化检测，以检测HBV DNA在肝脏组织的表达。本研究共注射受精卵2840枚，筛选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率为79.4％。注射完后立即将注射存活的受精卵移植假孕KM雌鼠，共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠妊娠率为49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只阳性，其中血清HBsAg ELISA检测阳性有5只，HBeAg检测均阴性。血清HBV DNA荧光定量PCR显示，其中2只小鼠的拷贝数大于102copy／ml。经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测阳性5只，HBsAgELISA检测阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性有2只，而HBcAg均为阴性。上述结果表明，本实验所构建的我国流行株C型HBV基因不但可以于转基因小鼠体内进行复制表达，而且可以在遗传给下一代小鼠。该转基因小鼠的研究对我国乙肝主要流行株C型HBV的基础研究和药物治疗及预防研究具有现实和指导意义。