论文摘要
应用饱和糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法调查郑州、商丘和洛阳三个地区的5个奶牛场、2个专业村的582份粪样,查出阳性样品64份,隐孢子虫总阳性率11%（64/582）,发现两种不同形态的卵囊,其中一种平均大小为7.25μm×6.33μm,卵囊形状指数为1.22。另一种平均3.32μm×3.16μm,形状指数1.05。根据其形态结构等特点鉴定为小球隐孢子虫（C. parvum）和安氏隐孢子虫（C. andersoni）。感染安氏隐孢子虫样品总阳性率为7.9%（44/582）;感染C. parvum的样品总阳性率为3.1%（20/582）。犊牛感染率较育成牛、成年牛高。所有阳性牛均无明显临床表现。小球隐孢子虫分离株对初生犊牛的致病性试验表明,其潜隐期为7d,排卵囊高峰出现在感染后第16d,高峰期5d。犊牛表现明显拉稀症状。剖检后消化道黏膜经抗酸染色鉴定,仅在回肠中段发现卵囊,电镜观察结果与光镜相同。 利用上述经实验室鉴定的牛安氏（C. andersoni）隐孢子虫卵囊,经蔗糖漂浮法收集和蔗糖密度梯度离心、滤器滤过、多次低速离心提纯后,通过冻融和超声波处理的全卵囊抗原免疫Balb/c小鼠4次,以PEG2000为促融剂,取阳性的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA方法筛选阳性孔,有限稀释法进行3至4次克隆,获得5株分泌抗牛安氏（C. andersoni）隐孢子虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1A3,3B10,3F4,4B3,4F11）。5株单抗的染色体数目均在96-98条之间,上清效价分别在1:100和1:12800之间,腹水效价分别在1:12800和1:204800之间。采用免疫荧光法对各株的单抗腹水进行初步鉴定,发现其中4株为抗卵囊壁单抗,1株为抗子孢子单抗。对其中3株单抗的腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量约为52.7kDa,轻链分子量约为24KDa。经Western-blotting分析,各株单抗所识别条带的分子量都在66kDa以上。 以同样方法纯化隐孢子虫卵囊制备免疫原,经油相苗、水相苗共6次免疫制备了兔抗安氏隐孢子虫抗体。提纯后用HRP标记IgG抗体,标记后的HRP浓度为1.4mg/mL,IgG浓度为1.755mg/mL,酶与抗体的摩尔比为1.18。选用4B3单抗与酶标兔抗建立了夹心ELISA试验,单抗的最佳稀释度为1:200,酶标抗体的工作浓度为1:400～800。在待检样品的3种处理方法中,以样品经超声波破碎后置液氮--37℃反复冻融后再检测的效果最好;乙醚脱脂处理后再同上处理,检测的OD值稍低;未经冻融处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品OD值显著偏低。夹心ELISA最低检出限为含100个卵囊/mL粪样。特异性试验表明:该方法对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力,其OD值与牛C. andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。
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