生物反应器内成骨细胞的扩增和组织工程骨的构建

论文摘要

骨组织工程（Bone tissue engineering）概念的提出为解决由于创伤、肿瘤等各种因素引起的骨缺损等疾病提供了一种崭新的方法和思路，已成为治疗骨科疾病的新突破点。生物反应器系统既可以揭示在三维培养环境中细胞功能的基本机制，又有提高工程化组织质量的功能。旋转壁式生物反应器（Rotating wall vessel bioreactor，RWVB）具有剪切力低、培养的细胞之间有三维联系的机会、极高的溶氧效率、营养物质浓度梯度低等特点，是一种非常理想的骨组织工程用三维培养系统。 本研究使用Sprague-Dawley（SD）大鼠和新西兰兔的成骨细胞（Osteoblasts，OBs）作为骨组织工程的种子细胞，对其原代、传代培养的方法和其特异性和形态学等生物学性能进行了检测，确定所培养的细胞是成骨细胞，并通过纯化确保没有其他细胞的污染，可为后续的实验提供数量充足的骨组织工程种子细胞，也为实验的准确性和可重复性提供了保证。 在相同条件下分别在培养瓶、转瓶（Spinner flask）和RWVB中使用微载体悬浮培养法进行了SD大鼠成骨细胞扩增培养的研究。培养7天后，经倒置相差显微镜、扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）、苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin，HE）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、MTT、von-Kossa染色和茜素红染色等生物学性能检测，结果显示RWVB中扩增的细胞能最好地保持成骨细胞的各种生物学特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。且当微载体的浓度为10mg／ml、成骨细胞的接种密度为5×104 cells／ml时，细胞在RWVB中可以获得最佳的扩增效果，每代可以扩增十倍以上，明显高于其它培养方式。 使用FLUENT软件模拟计算了旋转壁式生物反应器内的二维流场，计算了在反应器内进行细胞扩增和工程化组织构建时培养室内的动压、总压、剪切力和流体速度的分布，具体分析了当反应器的转速和旋转方向、中空纤维膜的径向位置和直径等发生改变时膜壁面各点的受力情况和流场分布。此外，还详细分析了当反应器的转速和旋转方向以及细胞-支架材料构建物的径向位置发生改变时构建物壁面各点的受力和流场分布情况。模拟结果显示在旋转壁式生物反应器内不同位置的中空纤维膜壁面和细胞-支架材料构建物壁面各点的动压、流体速度和剪切力随着反应器的旋转而发生周期性的变化，培养物可以获得周期性的应力刺激；反应器内流体的剪切力较低。 在上述理论分析的基础上，设计了旋转壁式中空纤维膜生物反应器（Rotating wall hollow-fiber embrane bioreactor，RWHMB），利用中空纤维膜作为成骨细胞的载体，以1×105 cells／ml接种密度在该反应器内对其进行大规模扩增，并在静态环境中以相同条件对照培养。每隔12 hr对细胞进行取样，培养5天后对细胞进行收获。对所扩增的细胞分别进行扫描电镜（SEM）观察、碱性磷酸酶（ALP）染色、钙化结节染色等生物学

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 骨组织工程种子细胞的研究进展
• 1.2.1 骨组织工程种子细胞的来源
• 1.2.2 种子细胞的分类
• 1.2.3 种子细胞的扩增
• 1.3 组织工程用生物支架材料研究进展
• 1.3.1 天然生物材料
• 1.3.2 人工合成生物支架材料
• 1.3.3 复合材料
• 1.4 工程化骨组织的体外构建
• 1.4.1 静态环境中构建
• 1.4.2 工程化骨组织的三维构建
• 1.5 骨组织工程的临床应用
• 1.6 本研究的选题依据和研究内容
• 参考文献
• 第二章 成骨细胞的获取，原代及传代培养与特性鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 实验仪器和材料
• 2.2.1 仪器设备
• 2.2.2 试剂及药品
• 2.2.3 实验动物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 成骨细胞原代培养
• 2.3.2 成骨细胞传代培养
• 2.3.3 成骨细胞的纯化
• 2.3.4 成骨细胞的生物学性能检测
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 原代培养结果
• 2.4.2 传代培养结果
• 2.4.3 成骨细胞的纯化结果
• 2.4.4 颅盖骨内细胞密度
• 2.4.5 成骨细胞的生物学性能检测
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 倒置显微镜和扫描电镜观察
• 3.3.2 成骨细胞生长曲线
• 3.3.3 成骨细胞扩增倍数比较
• 3.3.4 营养物质代谢
• 3.3.5 培养基的pH值和渗透压的变化
• 3.3.6 HE染色和碱性磷酸酶（ALP）染色检测
• 3.3.7 钙化结节染色结果
• 3.3.8 钙化结节的数量和分布
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 旋转壁式生物反应器内流场的数值模拟及分析
• 4.1 前言
• 4.2 软件和方法
• 4.2.1 GAMBIT和FLUENT
• 4.2.2 反应器流场的物理和简化模型
• 4.2.3 相关参数的设置和边界条件
• 4.3 计算结果与讨论
• 4.3.1 不同旋转方向和速度下反应器内固定有中空纤维模时的流场
• 4.3.2 中空纤维膜在反应器内变化径向位置的分析
• 4.3.3 中空纤维膜直径变化时的分析
• 4.3.4 细胞-支架材料复合物置于外筒壁处的分析
• 4.3.5 细胞-支架材料复合物在筒内其它位置的分析
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 成骨细胞在旋转壁式中空纤维膜生物反应器内的大规模扩增
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 倒置相差显微镜和扫描电镜观察
• 5.3.2 成骨细胞扩增倍数比较
• 5.3.3 培养基的pH值、渗透压的变化情况
• 5.3.4 葡萄糖、乳酸的变化
• 5.3.5 HE染色和碱性磷酸酶（ALP）检测
• 5.3.6 矿化结节染色
• 5.3.7 钙化结节的数量和分布
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 第六章 新型旋转壁式生物反应器内三维组织工程骨的构建
• 6.1 前言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 成骨细胞形态与功能检测
• 6.3.2 倒置显微镜下观察
• 6.3.3 扫描电镜观察
• 6.3.4 AO/EB双重荧光染色
• 6.3.5 钙化结节茜素红染色
• 6.3.6 营养物质代谢
• 6.3.7 pH值与渗透压
• 6.3.8 碱性磷酸酶检测
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 参考文献
• 第七章 组织工程骨在生物反应器内的构建与检测
• 7.1 前言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 方法
• 7.3 结果
• 7.3.1 成骨细胞转染-绿色荧光蛋白标记
• 7.3.2 转染细胞三维和静态构建组织工程骨
• 7.3.3 ALP染色和定量检测结果
• 7.3.4 I型胶原和BMP-2表达
• 7.3.5 不同构建方式下细胞的生长曲线和扩增倍数的比较
• 7.3.6 不同培养方式下的细胞周期和染色体分析
• 7.3.7 营养物质代谢分析
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 参考文献
• 第八章 组织工程骨修复兔挠骨大段骨缺损的研究
• 8.1 前言
• 8.2 材料和方法
• 8.2.1 组织工程骨的制备
• 8.2.2 实验动物分组
• 8.2.3 试验方法
• 8.2.4 检测指标
• 8.2.5 统计学方法
• 8.3 结果
• 8.3.1 大体观察结果
• 8.3.2 X线片观察结果
• 8.3.3 激光共聚焦纤维镜观察结果
• 8.3.4 组织观察结果
• 8.3.5 组织切片的图像分析
• 8.3.6 I型胶原和BMP-2表达
• 8.4 讨论
• 8.5 小结
• 参考文献
• 第九章 结论与展望
• 9.1 主要研究成果和结论
• 9.2 前景与展望
• 创新点摘要
• 英文缩略语
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 附录1
• 附录2
• 大连理工大学学位论文版权使用授权书