鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白B细胞结合表位的研究

论文摘要

传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是引起鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）的致病病原体,主要侵害雏鸡中枢免疫器官-法氏囊,对B淋巴细胞造成损伤从而引起严重的免疫抑制,受到IBDV侵害的雏鸡易感染其它传染病并有可能导致疫苗接种失败,给家禽养殖业造成巨大损失。IBDV主要衣壳蛋白VP2组成病毒颗粒的表面并携带有中和性抗原表位。研究表明:VP2蛋白253、279、284位氨基酸残基突变不仅导致IBDV强毒株与弱毒株的不同,更是弱毒能在鸡胚成纤维细胞及Vero细胞等非B淋巴细胞上增殖的原因,因此推测三个位点氨基酸残基的突变可能影响了病毒颗粒与细胞受体的结合。为揭示IBDV VP2蛋白与其易感细胞受体结合的特性,本研究在对VP2蛋白进行生物信息学分析的基础上,将VP2蛋白分为相互重叠的6个片段（A、B、C、B1、B2、B3）。以本实验室保存的VP2基因为模板,PCR扩增得到了六个重叠片段的基因,并以VP2全长片段为阳性对照,包装T7噬菌体,并对重组噬菌体进行鉴定。挑选出的阳性噬菌体经PEG沉淀纯化后,用FITC标记,并与3～6周龄雏鸡法氏囊B细胞、Vero细胞结合。荧光显微镜观察结果显示:展示有VP2全长蛋白、VP2高变区B肽段及覆盖B的三段多肽B1、B2、B3的T7噬菌体均能于B细胞及Vero细胞结合,流式细胞术分析结果表明各片段结合B细胞的强度均大于Vero细胞,但VP2与B2的结合能力强与其他片段。表明VP2蛋白高变区是结合细胞受体的部位,而B2（覆盖253、279、284位氨基酸残基）对其结合有重要作用。因此VP2蛋白结合细胞受体的表位可能分布在高变区不同的区域,通过空间折叠形成的三维结构中相互聚集而形成一结合区域,但也可能结合表位只分布在B2上,B1、B3与细胞受体较弱的亲和力来自与B2相互重叠的区域。为进一步验证VP2蛋白片段与细胞受体结合的特性,将VP2蛋白及B片段基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1,稳定转染COS7细胞,用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白,与B细胞及Vero细胞结合。结果显示阳性细胞能表达较好的绿色荧光,但重组蛋白与细胞作用后未发现荧光。可能是纯化过程中GFP蛋白失活导致荧光消失,或纯化的蛋白量太少,不能满足结合所需。重叠多肽扫描技术是鉴定配体表位及蛋白质相互作用的常用技术之一。本实验根据B2的氨基酸序列及空间结构特点,设计六条重叠多肽,Fmoc固相合成法合成并通过质谱仪鉴定。将六条多肽分别与B细胞及Vero细胞结合,再用荧光标记的展示有VP2蛋白的重组T7噬菌体与之作用,筛选出能有效抑制VP2蛋白与细胞受体结合的多肽。流式细胞术分析的结果表明多肽5t与6t对VP2结合细胞的抑制效果在B细胞与Vero细胞中均较为明显。在125μg/mL的时候就能显著抑制VP2与细胞的结合。两多肽重叠区含盖有关键氨基酸284位T,说明该氨基酸与B细胞及Vero细胞受体的结合是有关的。4n与细胞有一定的结合能力,这可能与该肽同样含有284位T有关,但其周围的氨基酸序列长短的不同影响了它与受体的结合。此外1h对B细胞有一定的抑制,而对Vero却不明显。本研究初步鉴定了强毒株IBDV VP2蛋白与细胞受体结合的可能性表位所在区,为从分子水平揭示病毒与宿主细胞的相互关系以及疫苗和多肽药物的开发提供了一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 前言
• 1 IBDV的结构及其基因组
• 2 IBDV的衣壳蛋白
• 3 IBDV的转录、复制、装配与释放
• 4 IBDV的致病机理
• 5 IBDV的毒力变化与细胞适应性
• 5.1 VP2与病毒毒力
• 5.2 VP2与病毒的细胞适应性
• 第二部分 IBDV VP2基因片段的噬菌体展示及重组噬菌体与细胞的结合鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 VP2基因、载体
• 1.2 试剂配制
• 1.3 VP2基因的扩增
• 1.4 VP2基因的克隆
• 1.4.1 PCR产物回收
• 1.4.2 大肠杆菌JM109感受态的制备
• 1.4.3 转化
• 1.4.4 阳性转化子的筛选与鉴定
• 1.4.5 序列测定与分析
• 1.5 VP2基因分段
• 1.6 VP2基因及其片段的噬菌体包装
• 1.6.1 VP2基因及其片段的酶切与回收
• 1.6.2 噬菌体包装
• 1.7 重组噬菌体的滴度测定
• 1.8 重组噬菌体的鉴定
• 1.8.1 重组噬菌体的PCR鉴定
• 1.8.2 序列测定
• 1.9 重组噬菌体扩大培养及纯化
• 1.9.1 噬菌体的扩大培养与保存
• 1.9.2 重组噬菌体的纯化
• 1.9.3 纯化噬菌体的鉴定
• 1.10 重组噬菌体的FITC标记
• 1.11 荧光标记的重组噬菌体与IBDV易感细胞的结合
• 1.11.1 鸡法氏囊B细胞,Vero细胞的制备
• 1.11.2 B细胞、Vero细胞与FITC标记噬菌体的结合
• 2 结果
• 2.1 VP2基因的扩增
• 2.2 重组质粒PCR与酶切鉴定
• 2.3 VP2基因的分段
• 2.4 噬菌体包装及重组噬菌体鉴定
• 2.5 噬菌体纯化结果
• 2.6 噬菌体FITC标记结果
• 2.7 荧光标记重组噬菌体于B细胞的结合
• 2.7.1 荧光标记的重组噬菌体与B细胞涂片结合的荧光检测
• 2.7.2 荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析
• 2.8 荧光标记重组噬菌体于Vero细胞的结合
• 2.8.1 荧光标记的重组噬菌体与Vero细胞涂片结合的荧光检测
• 2.8.2 荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析
• 3 讨论
• 3.1 VP2蛋白的分段
• 3.2 荧光标记的重组噬菌体制备
• 3.3 荧光噬菌体与B细胞及Vero细胞的结合
• 第三部分 VP2基因片段与的GFP融合分子在COS7细胞中的表达及与细胞的结合鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞、质粒和试剂
• 1.2 真核表达质粒pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的构建
• 1.2.1 VP2基因及其片段的扩增
• 1.2.2 VP2基因片段的克隆
• 1.3 细胞瞬时转染
• 1.3.1 质粒制备
• 1.3.2 COS7细胞培养和转染
• 1.3.3 荧光显微镜下观察和照相
• 1.4 细胞稳定转染
• 1.4.1 G418工作浓度的确定
• 1.4.2 质粒制备
• 1.4.3 细胞转染
• 1.4.4 阳性细胞的克隆化
• 1.4.5 细胞冻存
• 1.5 表达蛋白收集与纯化
• 1.5.1 表达蛋白纯化
• 1.6 纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合
• 2 结果
• 2.1 VP2及其片段的PCR扩增
• 2.2 重组载体pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的鉴定
• 2.3 重组质粒在COS7细胞中的瞬时表达
• 2.4 重组质粒在COS7细胞中的稳定表达
• 2.5 GFP-VP2与GFP-B融合蛋白的纯化及鉴定
• 2.6 纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合
• 3 讨论
• 3.1 GFP融合蛋白
• 3.2 COS7细胞
• 3.3 细胞转染及稳定表达外源蛋白细胞系的建立
• 3.4 融合蛋白的纯化及与细胞的结合实验
• 第四部分 重叠多肽扫描鉴定VP2与细胞结合表位
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 多肽的合成
• 1.2.1 VP2重叠多肽设计
• 1.2.2 VP2重叠多肽合成
• 1.3 多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制
• 1.3.1 细胞制备
• 1.3.2 细胞结合抑制多肽的筛选
• 1.3.3 阳性多肽抑制浓度的确定
• 2 结果
• 2.1 多肽设计与合成
• 2.2 多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制
• 2.2.1 多肽对B细胞结合T7-VP2的抑制
• 2.2.2 多肽对Vero细胞结合T7-VP2的抑制
• 2.2.3 阳性肽抑制浓度的筛选
• 3 讨论
• 3.1 多肽的设计、合成与检测
• 3.2 合成多肽与细胞的结合鉴定
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文