论文摘要
凝血是一个由多种蛋白质因子参与的复杂的级联过程。在哺乳动物中,与凝血相关的因子都是高度保守的。除此之外,在两栖类,爬行类,鱼类和鸟类中也发现了类似功能的凝血系统的相关因子。最近研究表明无颌类七鳃鳗中含有类似脊椎动物的凝血因子,但是在尾索动物海鞘中并没有发现类似的凝血因子存在。文昌鱼（amphioxus）是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的原索动物,是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。研究文昌鱼体内是否存在凝血系统的相关因子对于探索凝血系统的起源与进化有着重要的意义。抗凝血酶（antithrombin）是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（serpin）的成员之一,是凝血系统中的一个关键蛋白,作为凝血酶的主要抑制剂在血液凝集过程中维持着凝血与抗凝的平衡。本文克隆了青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）的抗凝血酶基因,命名为BbAT,并对它的结构、进化、表达和功能进行了研究。首先,利用兼并引物PCR和RACE技术克隆得到了具有完整编码框的文昌鱼的抗凝血酶基因（BbAT）,并利用生物信息学方法对其基因结构及系统进化地位进行分析。该cDNA的阅读框编码338个氨基酸,在1-336个氨基酸残基之间包含一个完整的serpin结构域。系统进化分析表明它属于serpin超家族的C分支（antithrombin）,但是与B分支（较古老的一类serpin）也有一定的同源性。进一步将BbAT和其他物种的antithrombin比较,发现此蛋白分别和爪蟾,鸵鸟,和人的antithrombin同源性较高,大约有40%的同源性。对BbAT的结构预测表明:其3个β-折叠和7个α-螺旋的结构与人的类似,尤其是它的反应中心环（RCL）在氨基酸组成上与脊椎动物的具有高度的相似性,这表明BbAT的功能很可能与脊椎动物的类似。哺乳动物的肝脏是antithrombin基因的主要合成器官,其他脏器如肺、脾、肾、心、肠、脑等也有少量合成。长期以来,文昌鱼的肝盲囊一直被认为是脊椎动物肝脏的前体。利用原位杂交技术检测BbAT在mRNA水平上在成体文昌鱼中的组织表达模式,结果表明BbAT基因在肝盲囊表达量较高,在卵巢、后肠、腮也有表达,而在精巢、肌肉、神经管和脊索没有杂交信号。可见,与哺乳动物类似,BbAT基因在成体文昌鱼组织中呈组织特异性表达。为了了解文昌鱼的BbAT是否与脊椎动物的一样具有抑制凝血酶的功能。本文利用毕赤酵母表达系统体外表达了BbAT的重组蛋白,命名为rBbAT。并用原核表达的重组蛋白制备了多克隆抗体,分别用发色底物法和Western blot的方法验证了rBbAT的蛋白功。利用发色底物试剂盒,根据以人的标准血浆为标准品制得的标准曲线,得出rBbAT抑制凝血酶的活力呈浓度依赖性,且肝素对它的抑制活力有一定的促进作用。另外rBbAT可以与凝血酶形成一种稳定的复合物,且体内也存在着的天然BbAT也有类似功能。综合以上结果,我们认为:文昌鱼体内存在着一类antithrombin,且其功能与脊椎动物的antithrombin类似。