论文题目: 伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 罗燕
导师: 郭万柱
关键词: 猪细小病毒,基因,生物信息学,伪狂犬病毒,重组病毒,基因工程活载体疫苗
文献来源: 四川农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究从四川某猪场流产死胎及木乃伊胎中分离了一株猪细小病毒,命名为PPV-SC1株。该株病毒能在猪肾原代细胞、PK-15细胞、ST细胞和IBRS-2细胞上增殖并引起细胞病变,细胞出现聚集、融合现象:分离毒能凝集2%的豚鼠红细胞,血凝效价可达2110,血凝抑制效价可达2-9;荧光抗体染色在细胞核和细胞质中均可见特异性荧光,呈苹果绿色;电镜正染观察病毒为无囊膜、球形、大小约23nm的病毒粒子。 根据Ana I.Ranz等报道的PPV NADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0 kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建了重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC1 VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异:密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC1 VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC1 NS1基因在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV—SC1 VP2蛋白在77-82、291-304、362-373、400-411、465-477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60-68、81-88、266-275、351-357、398-404等位点处。 以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuI位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据PPV-SC1株VP2基因的序列及其pPI-2.EGFP多克隆位点的酶切位点,重新设计一对引物,以质粒pPVP2 DNA为模板扩增得到用于表达的PPV VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,pPI-2.EGFP.VP2 DNA真核转染后24h的荧光观察和转染液的ELISA检测结果表明同时表达PPV VP2基因和EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2构建成功,为进一步构建PRY重组PPV VP2基因活载体病毒奠定了基础。 采用磷酸钙转染系统,将PRV基因缺失疫苗SA215株DNA与PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2 DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blots核酸
论文目录:
文献综述
1 猪细小病毒病原特性
2 猪细小病毒基因学研究进展
3 猪细小病毒病疫苗研究进展
试验研究
第一章 猪细小病毒的分离鉴定及其结构蛋白VP2基因的克隆和生物信息学分析
1 材料与方法
1.1 细胞和实验动物
1.2 质粒和菌株
1.3 酶和其它试剂
1.4 标准血清及诊断试剂
1.5 仪器设备
1.6 猪细小病毒的分离鉴定
1.7 猪细小病毒VP2基因的克隆及序列测定
1.8 PPV-SC1 VP2基因的生物信息学分析
2 试验结果
2.1 病毒的分离鉴定
2.2 PPV-SC1 VP2基因的克隆
2.3 PPV-SC1 VP2基因的生物信息学分析
3 分析与讨论
3.1 关于猪细小病毒的分离鉴定
3.2 关于PPV VP2基因的PCR扩增
3.3 关于克隆阳性质粒的鉴定
3.4 关于DNA序列的生物信息学分析方法思路及PPV VP2部分生物信息学分析
4 结论
第二章 含PPV VP2和绿色荧光蛋白双基因的PRV基因缺失表达载体质粒(pP1-2.EGFP.VP2)的构建
1 材料与方法
1.1 质粒和菌株
1.2 酶和其它试剂
1.3 仪器设备
1.4 含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒基因缺失转移载体质粒(pPⅠ-2.EGFP)的构建
1.5 表达用PPV VP2引物合成
1.6 表达用PPV VP2基因PCR扩增及其克隆和测序
1.7 含PPV VP2基因的PRV基因缺失表达载体质粒(pPⅠ-2.EGFP.VP2)的构建
1.8 pPⅠ-2.EGFP.VP2的转移特性及PPV VP2基因的表达检测
2 试验结果
2.1 含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒基因缺失转移载体质粒(pPⅠ-2.EGFP)的构建
2.2 表达用PPV VP2基因PCR扩增及其克隆和测序
2.3 含PPV VP2基因的PRV基因缺失表达载体质粒(pPⅠ-2.EGFP.VP2)的构建
2.4 pPⅠ-2.EGFP.VP2的转移特性及PPV VP2基因的表达检测
3 分析与讨论
3.1 关于转移载体
3.2 关于表达载体
3.3 关于筛选标记
3.4 关于pPⅠ-2.EGFP.VP2转染后的荧光检测和PPV VP2基因的表达检测
4 结论
第三章 伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株SA215(B)的构建及部分生物学特性研究
1 材料与方法
1.1 毒株和细胞
1.2 标准血清
1.3 酶和其它试剂
1.4 动物
1.5 仪器设备
1.6 伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株的构建
1.7 猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒株的部分生物学特性研究
2 试验结果
2.1 伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株的构建
2.2 绿色荧光检测及其病变观察
2.3 Dot-blots杂交检测鉴定重组病毒结果
2.4 SA215(B)病毒DNA的BamHⅠ酶切及Southern转印杂交检测
2.5 兔抗猪细小病毒IgG制备
2.6 SA215(B)表达PPV VP2基因的SDS-PAGE电泳及Western印迹分析结果
2.7 猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒株SA215(B)的部分生物学特性研究结果
3 讨论与分析
3.1 关于外源基因导入哺乳动物细胞的方法和重组病毒的构建
3.2 关于真核转染宿主细胞的选择
3.3 猪细小病毒的浓缩及提纯
3.4 关于蛋白质表达检测
3.5 关于猪细小病毒VP2基因在PRV SA215株中的表达
3.6 关于重组病毒SA215(B)株的部分生物学特性
4 结论
参考文献
致谢
附录
专业论文发表情况
发布时间: 2005-10-27
参考文献
- [1].猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究[D]. 赵俊龙.华中农业大学2001
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