论文摘要
分子医药农业（Molecular pharming）是通过利用转基因植物或动物作为生物反应器的技术手段,来获得具有药用价值的医药蛋白的方法；分子医药农业的核心技术就是生物反应器,即通过转基因植物或动物来实现规模化生产、成本较低、具有医用价值的重组蛋白或多肽。本研究利用实验室已经建立的水稻胚乳细胞表达平台成功表达了重组人碱性/酸性成纤维细胞生长因子,并研究其生物活性和纯化工艺,主要结果如下：1、利用水稻密码子的偏好性优化bFGF基因,将其插入到包含水稻谷蛋白Gt13a启动子和信号肽的载体序列中编号为pOsPMP277;构建好的载体pOsPMP277和质粒pOsPMP05通过农杆菌双侵染共转化到台北309水稻基因组中。通过Western blot检测,筛选到8个转基因纯合系,蛋白定量分析发现转基因系277-179的表达水平达到185.66mg/kg,其中OsrbFGF（Oryza sativa recombinant basic fibroblast growth factor）的可溶部分大约占9.55%。2、对OsrbFGF的N-末端测序结果表明：在OsrbFGF N-末端存在氨基酸（丙氨酸）的缺失,可能由于水稻内源性肽酶的剪切而丢失；分子量和等电点检测结果显示：OsrbFGF有两个分子量（16kDa和17kDa）和两个等电点（9.55和8.93）与天然bFGF（分子量约为17kDa,等电点为9.6）相比存在一定差异。3、对转基因T1代种子进行遗传学分析发现,277-122和277-179为双位点插入,277-223和277-238为单个位点插入；Southern blot杂交结果表明外源基因在水稻基因组中的拷贝数结果：277-122为3个拷贝,277-179为2个拷贝,277-223和277-238为1个拷贝。4、进一步细胞学分析显示OsrbFGF蛋白的表达造成了水稻胚乳细胞中蛋白体形态的改变；免疫电镜结果显示OsrbFGF蛋白分布在蛋白体Ⅰ、蛋白体Ⅱ和细胞质中,表明OsrbFGF可能以缺损模式（default trafficking）在胚乳细胞内转运。5、我们对OsrbFGF纯化工艺进行摸索,最终建立了1步肝素亲和层析方法纯化OsrbFGF:纯化后的OsrbFGF经SDS-PAGE考染结果显示只有单条带；纯化OsrbFGF纯度>95%；经过5kDa膜脱盐或者100kDa膜去除可能存在的内毒素,最终内毒素含量<1EU/μg；纯化得率为4.49%,即一公斤米粉可以获得8.33mg OsrbFGF。6、利用OsrbFGF进行的NIH/3T3细胞培养实验的结果表明：（I） OsrbFGF刺激NIH/3T3细胞增殖效应呈现剂量依赖性,OsrbFGF活性值约为1.04×106IU/mg;（II） OsrbFGF能有效刺激细胞增殖,其活性与美国Gibco公司大肠杆菌来源的重组碱性成纤维细胞生长因子（recombinant basic Fibroblast Growth Factor, rbFGF）等同。7、OsrbFGF的药效学评价结果表明：在伤口（割伤和烧伤）愈合早期,OsrbFGF可以通过促进细胞增殖和诱导CD68表达有效促进大鼠伤口的愈合；在伤口愈合后期,OsrbFGF通过降低CD68的表达水平来降低炎症反应,有利于后期伤口创面的组织重塑,防止伤疤的产生。8、利用相同方法表达重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF）。通过密码子优化合成的aFGF基因插入到包含Gtl3a启动子和信号肽的载体中,在To代苗期通过PCR检测获得了53株独立转基因系；Western blot杂交验证其中12株转基因系成功表达OsraFGF蛋白。9、对转基因株系107-33-2-3的T1代种子的遗传学分析,表达与不表达OsraFGF（Oryza sativa recombinant acidic fibroblast growth factor）种子的分离比例符合15：1,说明该转基因为双位点插入；Southern blot结果显示,外源的aFGF基因在水稻基因组中为3个拷贝。10、初步的细胞学研究表明：OsrFGF蛋白的表达没有对胚乳细胞中的蛋白体形态造成明显影响。11、对OsraFGF提取及纯化工艺进行了初步的探索。
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标签：植物分子医药农业论文; 水稻胚乳细胞表达平台论文;