论文题目: 拟南芥NAD（H）激酶在非生物胁迫中的功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 柴茂峰
导师: 王学臣
关键词: 拟南芥,激酶,氧化胁迫
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 盐渍、干旱和低温等逆境胁迫极大的影响着植物的生长,发育和繁殖,是农业减产的重要原因。环境胁迫可以引起植物体内活性氧的积累,导致细胞结构的氧化破坏,给植株带来严重伤害。 NAD(H)激酶是NADPH合成途径中的关键酶。近年来拟南芥中的NAD(H)激酶(NADK1,NADK2和NADK3)的序列已被发现,但在植物适应环境境胁迫应答中的功能及其作用机制还不清楚。本文利用分子生物学方法分析了NAD(H)激酶的表达特点和亚细胞定位,并利用突变体材料研究了其在环境胁迫应答中的功能及其可能机理。 利用细菌,酵母的的NAD(H)激酶基因与拟南芥基因组序列进行比较,推测拟南芥中可能有3个NAD(H)激酶类似基因。对NAD(H)激酶基因在正常组织及胁迫条件下的表达进行了分析,结果表明NADK3表达受冷、氧化胁迫及ABA的诱导,暗示NADK3可能参与植物逆境胁迫响应。 对NAD(H)激酶蛋白的氨基酸序列进行分析,发现NADK2的氨基酸序列分析发现在N端有一叶绿体定位信号,利用NADK2-GFP瞬时表达结果证实NADK2定位于叶绿体中。 对突变体与野生型拟南芥在胁迫条件下的表型进行分析表明。突变体nadk2在正常情况下,生长矮小,叶色黄绿。叶绿素含量明显低于野生型的。编码叶绿素合成中的两个关键酶PORB,PORC的基因表达水平也低于野生型的。表明,NADK2参与了叶绿素的合成。而且相对野生型来讲,该突变体对UVB,干旱,高温和高盐等可产生氧化胁迫的不良环境表现的更加敏感。突变体nadk3的分析表明,NADK3的缺失会导致植株对氧化胁迫的敏感性增加。 以上结果表明,在野生型拟南芥中,NAD(H)激酶是活性氧清除中的关键酶,在防止活性氧的过量积累、保护细胞内膜系统免受氧化伤害中具有十分重要的作用。我们的工作对进一步理解植物体体内的氧化清除系统有重要意义。
论文目录:
中文摘要
Abstract
缩略词
第一章 文献综述
1.1 生物体内的活性氧与清除活性氧系统
1.1.1 活性氧的种类
1.1.2 活性氧的生理作用
1.1.3 活性氧产生的主要部位
1.1.4 植物中的ROS清除酶系统
1.1.5 酵母中的NADPH代谢
1.1.6 细菌中的NADPH代谢
1.2 NAD(H)激酶的发现、种类与分布
1.3 本研究的目的与意义
第二章 拟南芥NADK激酶CDNA克隆及其表达分析
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 NADK激酶同源序列的搜索
2.2.2 NADK2，NADK3基因编码区的RT-PCR扩增及克隆
2.3 结果与分析
2.3.1 NADK基因的搜索及序列克隆
2.3.2 NADK基因的组织表达特性
2.3.3 NADK3基因在胁迫条件下的的表达特性
第三章 NADK基因的亚细胞定位
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验所需试剂配制
3.1.3 实验方法
3.2 结果与分析
3.2.1.NADK-GFP融合基因的载体构建
3.2.2 NADK2-GFP融合蛋白的瞬时表达
第四章 拟南芥NAD(H)激酶基因突变体抗逆性分析
4.1 材料
4.1.1 植物材料及胁迫处理
4.1.2 工程菌与质粒载体
4.1.3 试剂盒，杂交膜及放射性同位素
4.1.4 常用培养基
4.1.5 基因组DNA提取
4.1.6 Southern杂交
4.2.方法
4.2.1 NADK2，3突变体的鉴定
4.2.2 真核表达载体pCAMBtA 1391-NADK3构建与鉴定
4.2.3 Southem blot分析
4.2.4 农杆菌的转化
4.2.5 农杆菌介导的拟南芥转化(真空渗入法)
4.2.6 转基因拟南芥的鉴定
4.2.7 叶绿素的提取
4.2.8 NADPH含量测定
4.2.9 叶绿素中间代谢物的测定
4.2.10 RT-PCR分析下游基因的表达差异
4.2.11 胁迫处理
4.2.12 电子显微镜观察
4.2.13 气孔的测量
4.3 拟南芥NADK2突变体结果与分析
4.3.1 拟南芥NADK2突变体的鉴定
4.3.2 NADK2突变体叶绿素合成减少
4.3.3 NADK2突变体对环境胁迫敏感
4.4 拟南芥NADK3突变体结果与分析
4.4.1 拟南芥NADK3突变体的表型分析
4.4.2 拟南芥NADK3突变体的萌发率试验
4.4.3 拟南芥NADK3突变体的ABA抑制剂试验
4.4.4 拟南芥NADK3突变体中胁迫基因的表达
第五章 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简历
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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