论文题目: 新型siRNA表达载体、随机siRNA文库的构建及基于随机siRNA文库的细胞增殖相关基因筛选
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 张丽姝
导师: 沈岩,梁子才,陈梅红
关键词: 小干扰,随机文库
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 自2001年确认小干扰RNA(siRNA)可以在哺乳动物细胞诱导特异的RNA干扰(RNAi)效应以来，RNAi技术迅速在哺乳动物细胞中得以广泛应用，并在小规模的功能基因筛选研究中显示了卓越的性能。在几种siRNA表达载体中，短发夹形式的siRNA载体因较好的表达性能和相对简便的操作最为引人注目。然而，短发夹形式的siRNA编码序列带来了连接效率低和测序难等问题。更重要的，体外获得发夹样siRNA编码序列的过程较为复杂，以此载体构建siRNA文库在技术上难度较大，这是目前限制RNA干扰应用于哺乳动物更大规模功能基因筛选的主要障碍。为此本课题首先致力于构建一种新型的相向双启动子siRNA表达载体。这种载体中siRNA编码序列是一段普通的双链DNA，因此上述与短发夹结构相关的一切问题均将迎刃而解。我们进一步用这种新载体构建了一种随机siRNA文库，并用此文库进行细胞增殖相关基因筛选研究，以期为哺乳动物大规模的基因功能研究探索新技术平台。 我们设计的新型相向双启动子siRNA表达框结构为：两个RNA聚合酶(Pol)Ⅲ启动子以相反方向排列，中间为siRNA的编码序列。这样两个启动子就可以从两个方向分别转录中间siRNA编码区的两条链。在对H1和U6两种polⅢ启动子进行了适应这种新型表达框的启动子末端突变后，我们构建了siRNA瞬时表达质粒pDH(基于H1／H1双启动子)和pBUH(基于H1／H6双启动子)，以及真核稳定表达质粒pCUH、pEG-UH(均基于H1／U6双启动子)。用针对荧光素酶报告基因的RNA干扰实验及siQuant siRNA活性评价系统检测这些质粒的有效性，结果显示用这些载体表达siRNA，可以获得与化学合成的siRNA及发夹结构载体表达的siRNA相当的抑制效果。RNase保护实验也直接检测到pCUH质粒在细胞中所表达siRNA的正义链和反义链，进一步说明这种相向双启动子表达框可以有效表达siRNA。 相向双启动子siRNA表达载体使siRNA文库的构建工作更为简便。为了注释基因组中大量的未知基因，构建一个基因组水平的siRNA文库，实现真正基因组水平的大规模筛选是关键，为此我们构建了一种随机siRNA文库。此文库中的siRNA编码区是一段随机DNA序列，理论上这一文库可以涵盖所有可能的siRNA序列。随机siRNA编码序列通过化学合成的方法得到，一条含18NC随机序列的长链和一条与其3′端已知序列互补的短链通过体外的退火补平步骤形成含18NC区的完全双链
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 相向双启动子siRNA表达载体的构建及验证
前言
材料与方法
实验结果
讨论
第二章 随机siRNA文库及其在细胞增殖相关基因筛选中的应用
前言
实验方法
实验结果
讨论
小结
参考文献
综述 RNA干扰:机制及应用
致谢
附录 引物序列
个人简历
发布时间: 2006-10-13
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