梅花栽培品种基因组DNA的AFLP指纹图谱研究

论文摘要

梅花（Prunus mume）属蔷薇科（Rosaceae）李亚科（Prunoideae）李属（Prunus）,中国是梅的自然分布中心、栽培中心和研究中心。目前梅花栽培品种数量众多,观赏性状多样,其中的宫粉型品种,种间杂合度较高,品种间性状特征差异非常之小,传统的形态学鉴定方法已经很难有效的区分,品种鉴定的难度系数提高;对于梅花的品种起源与演化问题,种间和种内复杂的亲缘关系、遗传变异和遗传多样性等方面的研究还不是很彻底;优异、特有性状基因的标记与定位、梅种质资源的基因频率图式分析等研究工作还刚刚起步。针对以上问题,本研究首先详细调查整理了目前我国大部分已保存的梅花栽培品种,在此基础上,对梅花栽培品种进行了AFLP分子标记实验,采用NTSYS 2.1t等分析软件,建立了具有“分子身份证”功能的AFLP基因图谱,探讨了部分品种种间及种内的亲缘关系和遗传变异情况,对形态学上难以区分的品种进行了分子水平的鉴定,将分子标记的聚类结果与形态学分类体系进行了比较研究。主要结论如下:1.对中国最大的梅花品种资源圃武汉中国梅花研究中心和南京中山陵梅梅园目前所保存的梅花品种进行了系统全面的调查整理,共整理出350个品种,包含梅花品种的3系5类18型。对调查的两地的品种资源进行了总结,其中保存数量仅为15株的品种有:‘品字’梅、‘丽悬’、‘黄金梅’、‘云南丰后’、‘龙游’和‘残雪’、‘双碧垂枝’等部分垂枝梅类品种,对具有跳枝、洒金和台阁等典型性和特异性性状的品种做了概括评价。2.对基因组DNA的提取方法进行了改良和优化,得到了质量高、浓度纯、适于AFLP反应的DNA模板。与前人所用方法相比,本研究优化后的方法适合梅花干燥叶片的DNA提取,为梅花的国际品种登录,新品种的鉴定提供了较简便易行的操作方法。进一步对适合梅花的AFLP银染反应体系进行了构建和优化,在酶切连接的时间和反应体系、DNA模板和产物模板的浓度、两次扩增反应体系,以及最后的电泳、银染显影操作技术等多个影响实验结果的因素进行了优化。优化后的体系得到了扩增较稳定,分辨率和多态性都较高的指纹谱带。3.利用EcoRⅠ-MseⅠ的酶切组合,从156对引物组合中筛选出5对条带丰富、扩增整齐、多态性高的引物组合,对22个代表性梅花栽培品种进行AFLP分子标记实验。结果5对引物组合共得到415条可统计的条带,其中187个为多态性位点,平均多态性为45.1%。分别采用不同相似性系数（SM系数、J系数和DICE系数）和Nei’s遗传距离进行数据分析。结果表明:梅品种间存在着较大的遗传多态性,主要表现在真梅系和杏梅系与樱李梅系之间。聚类分析结果能明显区分开梅的3个种系,基本上与形态学分类吻合,支持将种系和枝姿分别作为梅花分类的第一、二级标准。有明显亲缘关系的杂交品种聚为一组,说明AFLP技术能研究梅品种间复杂的亲缘关系。4.利用AFLP技术对163个梅花品种进行分子标记,5对引物组合共得到459条可统计的条带,平均多态率为37.47%。并以引物组合E-ATA/M-CTG为例,对所得到的指纹谱带数据,计算相似性系数、进行聚类分析。将聚类结果分别从种系、类和型的划分上与形态学分类体系进行比较研究。结果表明,AFLP分子标记在种系和类的划分上基本与传统的形态学分类一致。直枝梅类中,江梅型、朱砂型、绿萼型、玉蝶型品种种内聚合较为集中;同时也存在着一定程度的遗传分化:宫粉型品种变异分化较明显,种间杂合度较高,可能品种来源不同,对该型的品种划分和鉴定还需要结合分子标记的方法进行更深入的研究;洒金型和黄香型之间没有显示出很大的差异,推测都为杂交起源、有一定的亲缘关系或是某些基因型表达的不稳定性所致。垂直梅类聚合较集中,说明枝姿是梅品种形态特征中较重要的观赏性状,垂直梅类有较近的亲缘关系,遗传较稳定,变异分化不明显。以上研究为进一步加强对我国野生、半野生梅种质资源和栽培品种资源的保护、开发和利用、优异特有基因资源的发掘研究、梅国际品种登录的申请奠定基础;同时为结合形态分类方法对梅品种进行分子水平的分类研究和品种鉴定,系统研究梅的品种起源、亲缘关系和遗传变异,为分子辅助育种、重要性状基因的标记、定位与克隆,梅种质资源的分子评价和分子身份证的构建以及建立已登录品种的标准指纹档案提供分子水平的理论基础和技术支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 梅花研究概况
• 1.1.1 梅种质资源研究进展
• 1.1.2 梅花遗传育种研究
• 1.1.3 梅花授粉生物学与繁殖技术研究
• 1.1.4 梅花栽培与生理学研究
• 1.1.5 梅花分子生物学研究
• 1.1.6 新品种的国际登录与保护
• 1.2 分子标记及其在植物育种中的应用
• 1.2.1 分子标记的类型
• 1.2.2 常用分子标记的基本原理及其应用
• 1.3 AFLP 分子标记及其应用
• 1.3.1 AFLP 的原理、技术流程和特点
• 1.3.2 AFLP 技术在观赏植物中的研究应用
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 梅花品种资源的调查整理与现状分析
• 2.1 梅花的品种资源调查
• 2.1.1 调查地点与调查方法
• 2.1.2 调查结果
• 2.2 梅品种资源的现状分析
• 2.2.1 调查结果分析
• 2.2.2 梅花品种资源分析
• 2.2.3 宫粉型品种资源分析
• 2.3 讨论及小结
• 第三章 AFLP 银染反应体系的构建和优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 DNA 的提取及检测
• 3.2.2 酶切连接时间和模板浓度的确定
• 3.2.3 酶切连接产物的检测
• 3.2.4 预扩增产物的检测
• 3.2.5 选择性扩增产物的检测
• 3.3 讨论及小结
• 第四章 梅花栽培品种间的亲缘关系和遗传变异分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 接头和引物
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.4 实验数据的记录和分析方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 AFLP 内切酶的选择和引物筛选
• 4.2.2 AFLP 选择性扩增结果
• 4.2.3 聚类结果与分析
• 4.2.4 梅品种间亲缘关系和遗传变异分析
• 4.3 讨论及小结
• 第五章 梅花栽培品种的AFLP 指纹图谱分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 接头和引物
• 5.1.3 实验方法
• 5.1.4 实验数据的记录分析方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 AFLP 选择性扩增结果
• 5.2.2 聚类结果及分析
• 5.2.3 梅花形态分类和亲缘关系研究
• 5.3 讨论及小结
• 5.3.1 分子标记与梅品种形态学分类
• 5.3.2 指纹图谱与遗传亲缘关系
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢