白藜芦醇对小鼠脑缺血再灌注损伤不同阶段的保护机制研究

论文摘要

脑缺血性疾病是神经系统常见病变,可导致严重的神经功能障碍并威胁人类的健康和生命。工业化国家每10万人中有250400人发生脑缺血,死亡率约为30%,属于人类死亡的第三大原因。因此,研究脑组织缺血后再灌注过程的分子机制和治疗方法成为国内外学者的热点课题。白藜芦醇（Resveratrol,Res）化学名称为3 ,5 ,4-三羟基苯二烯,是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或药物中的多酚类活性单体。自1940年人们首次从毛叶藜芦的根部分离获得Res以来,陆续开展了对其药理活性的探讨,结果表明Res具有抗癌、抗炎、抗氧化、诱导细胞凋亡及雌激素调节等多方面药理活性。近年来大量实验表明,Res对抗缺血性损伤具有潜在的作用。本研究应用小鼠脑缺血再灌注模型,进一步探讨了Res对小鼠脑缺血再灌注损伤急性期和恢复期的保护作用,并且分别从蛋白、基因水平研究了Res与恢复期脑缺血再灌注损伤发生密切相关的基质金属蛋白酶-2和血管内皮生长因子的关系。旨在进一步探讨Res对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制,为临床应用Res治疗脑缺血性疾病奠定理论基础。一、Res对小鼠局灶性缺血再灌注后急性期的影响目的证实Res对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用,进一步探讨其与过氧化物酶体增殖物激活受体α的关系。方法选用健康雄性Balb/c小鼠,随机分为单纯缺血组、Res组及菲诺贝特组。采用插线法建立暂时性大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型,MCAO时间为120 min。于手术后24h分别对各组小鼠进行神经功能评分。脑组织切片行HE染色,光镜观察缺血区域及其周围细胞形态特征。并获取完整端脑,切成2 mm冠状厚片,2%红四氮唑（TTC）染色,计算梗塞体积和水肿程度,进行统计学分析。Evans blue染色观察血脑屏障破坏程度,进行统计学分析;另外,提取总RNA,采用RT-PCR技术检测过氧化物酶体增殖物激活受体α的mRNA表达水平。结果Res和菲诺贝特能够减少脑梗塞体积（43.80±5.31 mm3、45.57±5.63 mm3 VS 63.87±9.33 mm3,P<0.01）,减少Evans blue外渗的体积（58.66±4.65 mm3、78.72±5.78 mm3 VS 102.06±6.07 mm3,P<0.01）和含量（6.40±0.92 ug/g、12.47±1.24 ug/g VS 15.25±1.51 ug/g,P<0.01）,增强过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达[（0.893±0.028）、（1.117±0.042） VS（0.467±0.013）,P<0.01]。结论Res对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,减轻了血脑屏障的破坏和脑梗塞的程度,这可能得益于其诱导过氧化物酶体增殖物激活受体α表达增高,从而对脑缺血再灌注损伤急性期起到保护作用。二、Res对小鼠脑缺血再灌注损伤恢复期的保护作用目的证实Res对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后恢复期的保护作用,进一步探讨其与缺血脑组织内基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase 2,MMP-2）及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）的关系。方法选用健康雄性Balb/c小鼠,采用插线法建立暂时性大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型,MCAO时间为120 min。随机分为5组:对照组:实验动物于MCAO前5 min接受相应体积的20%环糊精/0.9%NaCL强饲,每天1次,直至第7 d;缺血组:实验动物于MCAO前5 min接受Res强饲（溶于20%环糊精/0.9%NaCL）,50 mg/kg,每天1次,直至第7 d;再灌注组:实验动物于再灌注前5 min接受Res强饲（溶于20%环糊精/0.9%NaCL）,50 mg/kg,每天1次,直至第7 d;一天组:实验动物于再灌注后24 h接受Res强饲（溶于20%环糊精/0.9%NaCL）,50 mg/kg,每天1次,直至第7 d;三天组:实验动物于再灌注后72 h接受Res强饲（溶于20%环糊精/0.9%NaCL）,50 mg/kg,每天1次,直至第7 d;于手术后第7 d分别对各组小鼠进行神经功能评分。获取完整端脑,切成2 mm冠状厚片,2%红四氮唑（TTC）染色,计算梗塞体积和水肿程度,进行统计学分析。应用免疫组织化学的方法对脑组织冠状切片进行CD34染色并统计微血管数量。另外,提取总蛋白或总RNA,采用Western Blot和RT-PCR技术分别从蛋白和基因水平检测VEGF和MMP-2的表达。结果与对照组相比,缺血组和再灌注组的神经功能评分和梗塞体积明显降低（P<0.05）;缺血组、再灌注组和一天组皮层区域的微血管减少的数目与对照组相比较有明显差异（P<0.05）;缺血组和再灌注组VEGF和MMP-2的蛋白和基因表达均高于对照组（P<0.05）。结论Res对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤恢复期具有明显的保护作用,这可能得益于其在缺血再灌注损伤后的早期应用,促进了血管形成,增加了VEGF和MMP-2的表达,从而促进了恢复期脑缺血再灌注损伤小鼠的功能恢复。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 Res 对小鼠局灶性缺血再灌注后急性期的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 Res 对小鼠局灶性缺血再灌注后恢复期的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢