App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎与猪肺疫为猪场常见细菌性呼吸道传染病,常呈混合或继发感染,给养猪业带来巨大危害。生产实践中,接种疫苗是防治该病的最好方法。常用灭活苗对于异种血清型菌株感染不具保护作用,无法阻止菌体定殖,为生产实践带来一定困难。菌影疫苗是一种新型疫苗形式,制备过程中,膜表面抗原保留完好,可有效诱导体液免疫与细胞免疫。因此,菌影无论作为疫苗还是载体都具有广泛利用价值。本试验以噬菌体PhiX174基因组和金黄色葡萄球菌基因组为模板,通过PCR方法,扩增裂解蛋白E基因及核酸酶A基因（SN）。引物设计时加入linker序列,采用降落PCR方法实现E与SN基因的串联（E-15aalinker-SN）。将E基因与E-15aalinker-SN基因插入温控表达载体pBV220,构建温控单基因表达系统pBV-E和温控双基因表达系统pBV-E-15aalinker-SN。以pBV-E-15aalinker-SN质粒为模板,通过PCR方法对温控双基因裂解盒（DLS）进行扩增,构建重组克隆载体pMD-WK。酶切DLS,将其插入E. coli-App穿梭载体（pMC-Express）,构建温控双基因裂解载体pMC-WK。裂解试验表明,E-15aalinker-SN裂解效果优于E,表现为裂解迅速而彻底,菌体裂解率可达99.999%;经PCR扩增的DLS具有生物学活性,表明DLS扩增成功。通过接合转化方式将pMC-WK导入胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）,成功制备出App菌影。以多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）基因组为模板,通过PCR方法扩增外膜蛋白ompH基因。以真核表达载体pCDNA3.1（+）为骨架,构建pCDNA-ompH。以其作为DNA疫苗,通过浸泡,将pCDNA-ompH质粒载入App菌影。小鼠免疫试验表明:App菌影装载pCDNA-ompH疫苗对猪胸膜肺炎放线杆菌与猪多杀性巴氏杆菌感染具有保护作用,保护率可达100%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 研究目的和意义
• 2 研究现状
• 2.1 胸膜肺炎放线杆菌的研究现状
• 2.2 多杀性巴氏杆菌的研究现状
• 2.3 菌影
• 2.4 DNA 疫苗
• 2.5 粘膜免疫系统与粘膜免疫
• 3 本研究的特色
• 第二章 温控双基因裂解系统的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因的扩增
• 2.2 重组克隆质粒及其双酶切结果
• 2.3 目的基因序列测定
• 2.4 重组温控表达质粒及其双酶切结果
• 2.5 温控双基因裂解盒（DLS）扩增结果
• 2.6 DLS 重组克隆载体及双酶切结果
• 2.7 载体示意图
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 温控双基因裂解系统生物学活性检测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 裂解试验
• 2.2 SDS-PAGE 试验
• 3 讨论
• 3.1 温控表达系统
• 3.2 二价阳离子对菌影制备的影响
• 3.3 菌影制备过程的有效监测方式
• 4 小结
• 第四章 App 菌影的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组穿梭载体酶切结果
• 2.2 裂解试验结果
• 2.3 载体示意图
• 3 讨论
• 3.1 转化方法的选择
• 3.2 App （pMC-WK）的裂解特点
• 4 小结
• 第五章 多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH 真核表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 ompH 扩增结果
• 2.2 ompH 测序结果
• 2.3 重组真核表达载体pCDNA-ompH 及其双酶切结果
• 2.4 质粒示意图
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 疫苗免疫效果评价
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 App 感染对小鼠最小致死量的测定结果
• 2.2 Pm 感染对小鼠最小致死量的测定结果
• 2.3 无菌检验
• 2.4 安全性检验
• 2.5 疫苗保护效果比较结果
• 3 讨论
• 3.1 菌影产物安全性
• 3.2 菌影的佐剂特性
• 4 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文