含Rolipram的新型纳米纤维支架和NSCs移植对颅神经损伤后的治疗作用的研究

论文摘要

第一部分NSCs的培养、鉴定及GFP标记目的：分离、培养和纯化大鼠成体NSCS。构建表达GFP的慢病毒载体对NSCs进行GFP标记。方法：应用无血清培养液培养并纯化从大鼠胎鼠海马分离得到的细胞,通过有限稀释法验证其具有自我增殖的能力,通过免疫荧光染色标记验证其能否分化为神经元和星形胶质细胞。制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心纯化成不同浓度的浓缩病毒,再转染NSCs。结果：可以应用无血清培养液从大鼠胎鼠海马培养并纯化NSCs,其在体外具有自我增殖和分化的能力。可以通过慢病毒载体介导对NSCs进行GFP标记。结论：应用无血清培养液自大鼠胎鼠海马内成功分离培养出NSCS。慢病毒载体介导的GFP可对NSCs进行有效标记。第二部分Rolipram对NSCs体外培养的药物浓度筛选目的：在体外培养情况下,了解不同浓度Rolipram对NSCs活性的影响,并筛选其可促进神经元突起生长的最适浓度。方法：将NSCs放在含不同浓度Rolipram的NSCs培养液中培养,通过CCK-8法连续测定不同时间的OD450值,了解不同浓度Rolipram对NSCs舌性的影响；将NSCs在含不同浓度Rolipram的NSCs分化液中培养,通过测定NSCs分化后的神经元轴突长度,选择合适的Rolipram浓度。结果：不同浓度的Rolipram对NSCs体外培养的细胞活性均有一定的影响；NSCs在含0.25 u M浓度Rolipram的分化液中体外培养的神经元突起长度最长。结论：在体外培养情况下,0.25 u M浓度的Rolipram对NSCs活性影响最小,对神经元突起生长促进作用最明显。第三部分NSCs、Rolipram与PLGA纳米纤维支架联合移植治疗SD大鼠坐骨神经缺损目的：探讨联合应用NSCs、Rolipram与PLGA纳米纤维支架移植治疗SD大鼠坐骨神经缺损的效果方法：建立SD大鼠坐骨神经缺损模型,移植不同的组织工程神经支架,12周后通过行为学观察、神经电生理测定,组织学及免疫组化标记等了解其对周围神经再生的作用。结果：不同组合的组织工程神经支架均可以使SD大鼠的坐骨神经缺损损伤后再生：1.含Rolipram的PLGA纳米纤维支架和NSCs联合移植治疗SD大鼠坐骨神经缺损伤效果优于单纯支架,支架+Rolipram/NSCs组（p<0.05）；2. PLGA支架+Rolipram/NSCs组优于单纯PLGA支架组（p<0.05）；3. PLGA支架+Rolipram与PLGA支架+NSCs组无明显统计学差异（p<0.05）。结论：PLGA纳米纤维支架与NSCs、Rolipram联合应用移植治疗SD大鼠坐骨神经缺损的效果好于其单独应用。第四部分NSCs、Rolipram与PLGA纳米纤维支架联合移植治疗猕猴面神经缺损初步结果目的：进一步验证联合应用NSCs、Rolipram与PLGA内米纤维支架移植治疗猕猴面神经神经缺损的效果方法：建立猕猴面神经缺损模型,移植不同的组织工程神经支架,12周后通过行为学观察、神经电生理测定,组织学及免疫组化标记等了解其对颅神经再生的作用。结果:不同组合的组织工程神经支架均可以使猕猴面神经缺损损伤后再生,三者联合应用神经功能恢复得最快。结论：PLGA纳米纤维支架与NSCs、Rolipram联合应用移植治疗猕猴面神经神经缺损效果较好。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 NSCs的培养、鉴定及GFP标记
• 实验一 NSCs的培养与鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 实验二 NSCs的GFP标记
• 材料与方法
• 结果
• 讨论一
• 讨论二
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 Rolipram对NSCs体外培养的药物浓度筛选
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 NSCs、Rolipram与PLGA纳米纤维支架联合移植治疗SD大鼠坐骨神经缺损
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 NSCs、Rolipram与PLGA纳米纤维支架联合移植治疗猕猴面神经缺损初步结果
• 材料和方法
• 结果
• 附图及表格
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 附录:综述
• 参考文献
• 后记
• 个人小结