烟草青枯病拮抗真菌的筛选、鉴定及活性产物研究

论文摘要

烟草青枯病是由茄青枯劳尔氏菌属的假单胞杆菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性病害,多发于热带、亚热带烟区,在我国主要是长江流域及其以南烟区,其中以四川、广东、福建、湖南及贵州烟区最为严重,发病重的地块产量损失可达80%以上。传统的化学防治方法成本高、污染重,轮作和微生物防治成为解决此问题的重要方案。其中,微生物防治方法具有无污染、无公害、长效性等优点,能从根本上解决了药剂残留、病原菌抗药性等问题的影响,有利于环境的净化和生态资源的良性循环。本研究针对烟草青枯病菌,主要进行了拮抗真菌的筛选、鉴定、发酵条件优化、发酵液育苗试验及活性产物稳定性的研究。主要研究结果如下：1.采用稀释法从重庆黔江烟区健康土壤中分离到59株真菌。采用滤纸片法进行筛选,获得了对烟草青枯病菌具有较强拮抗活性的2个真菌菌株,编号为3F03和7F06,其抑菌圈直径分别为：10.0mm和9.5mm。经反复平板拮抗试验,抑菌圈直径无明显差异。2.通过对菌株3F03和7F06的形态和培养特征观察、全细胞脂肪酸分析和rDNA ITS序列分析,初步鉴定结果显示：拮抗真菌3F03和7F06分别为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和浅黄新萨托菌(Neosartorya aureola)。3.以菌株3F03和7F06发酵液处理的烟苗生长状况良好,与对照相比,在种子发芽率、苗高、苗重、根长及根重方面都没有显著的变化。其中,稀释10倍的3F03发酵液和稀释100倍的7F06发酵液两个处理有一定程度的促生作用。4.以代谢产物的抑菌活性及产量为指标,初步确定了菌株3F03的最佳发酵条件为：发酵温度28℃、发酵时间96h、接种量5%、装液量50mL／150mL；菌株7F06的最佳发酵条件为：发酵温度28℃、发酵时间120h、接种量3%、装瓶量1OOmL／150mL。5.以不同处理下代谢产物的抑菌活性为指标,测定了菌株3F03和7F06活性产物的稳定性。发现菌株3F03的活性产物的热、pH和紫外稳定性较好,经蛋白酶K和胰蛋白酶处理抑制率仅分别下降了17.0%、14.5%；菌株7F06的活性产物抗紫外线和蛋白酶的能力较强,酸性环境下抑菌活性仅稍有下降,活性产物经80℃以上高温处理后抑菌能力基本丧失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1 环境有益微生物对植物病害的生物防治
• 1.1 环境有益微生物的生防机制
• 1.1.1 竞争作用
• 1.1.2 抗生作用
• 1.1.3 溶菌作用
• 1.1.4 寄生作用
• 1.1.5 诱导抗性
• 1.2 环境有益微生物的种类
• 1.2.1 拮抗细菌
• 1.2.2 拮抗真菌
• 1.2.3 拮抗放线菌
• 2 烟草青枯病的研究
• 2.1 病原菌
• 2.2 发病症状
• 2.3 侵染循环
• 2.4 发生条件
• 3 烟草青枯病的综合防治
• 3.1 选育抗病品种
• 3.2 农业防治
• 3.2.1 合理轮作和套种
• 3.2.2 培育无病壮苗
• 3.2.3 实行合理耕作
• 3.3 化学防治
• 3.4 生物防治
• 3.4.1 植物源的生物防治
• 3.4.2 微生物源的生物防治
• 4 绪论
• 4.1 选题背景和意义
• 4.2 研究内容
• 第2章 烟草青枯病拮抗真菌的分离、筛选及鉴定
• 1 试验材料
• 1.1 供试病原菌
• 1.2 拮抗真菌分离材料
• 1.3 培养基
• 1.4 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 土壤真菌的分离
• 2.1.1 取样
• 2.1.2 土壤悬浮液的制备
• 2.1.3 平板接种
• 2.1.4 真菌的分离、纯化与保存
• 2.2 拮抗真菌的筛选
• 2.2.1 活性产物的粗提取
• 2.2.2 滤纸片法测定粗提物的抑菌活性
• 2.3 拮抗真菌的分类鉴定
• 2.3.1 形态特征观察
• 2.3.2 全细胞脂肪酸分析
• 2.3.3 rDNA ITS序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 土壤真菌的分离
• 3.2 拮抗真菌的筛选
• 3.3 拮抗真菌的分类鉴定
• 3.3.1 形态特征及培养性状
• 3.3.2 全细胞脂肪酸分析
• 3.3.3 rDNA ITS序列分析
• 4 讨论
• 4.1 拮抗真菌的分离筛选
• 4.2 拮抗真菌的鉴定
• 第3章 烟草育苗试验及拮抗真菌发酵条件的优化
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 烟草品种
• 1.3 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 拮抗真菌发酵液的育苗试验
• 2.2 拮抗真菌发酵条件优化
• 2.2.1 发酵条件的正交试验
• 2.2.2 测定粗提物的抑菌活性
• 3 结果与分析
• 3.1 拮抗真菌发酵液对烟草育苗的影响
• 3.2 拮抗真菌发酵条件优化
• 3.2.1 菌株3F03发酵条件的优化
• 3.2.2 菌株7F06发酵条件的优化
• 4 讨论
• 4.1 烟草的发酵液育苗试验
• 4.2 拮抗真菌的发酵条件
• 第4章 拮抗真菌活性产物的稳定性研究
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 菌株发酵
• 2.2 热稳定性
• 2.3 酸碱稳定性
• 2.4 UV稳定性
• 2.5 抗蛋白酶稳定性
• 3 结果与分析
• 3.1 热稳定性
• 3.2 酸碱稳定性
• 3.3 UV稳定性
• 3.4 抗蛋白酶稳定性
• 4 讨论
• 4.1 活性产物稳定性
• 4.2 活性产物分离
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文