论文摘要
针对经皮给药的释药和吸收特点,本课题应用PK-PD结合模型,在浓度—时间—效应三维图谱中,探讨环维黄杨星D以小剂量、持效的新剂型代替原有剂型的可行性和优越性,并且分析中药单一成分与有效部位制剂的相关性。以期为环维黄杨星D的临床给药方案提供更为科学的依据,同时亦为其它中药经皮给药系统的临床应用提供借鉴,促进中药新型给药系统的发展。全文分以下四个部分阐述:1微透析采样技术的方法学及影响因素的研究1.1环维黄杨星D HPLC分析方法的建立环维黄杨星D分子结构中不含双键,紫外区末端直接测定困难,灵敏度低。利用其结构含仲氨基的特点,采用异氰酸苯酯为衍生化试剂,柱前衍生化后HPLC法测定。确定的色谱条件为:BDS-C18色谱柱,流动相为甲醇:水（85:15）,流速为1.0ml/min,进样量为10μl,检测波长为240nm,理论塔板数按环维黄杨星D峰计算不得低于3000。1.2灌流液改性剂对回收率的影响环维黄杨星D（cyclovirobuxine D,CVB-D）属孕甾烷衍生物,是脂溶性生物碱。正常情况下,用微透析技术采样后,结果在液相中检测不到CVB-D。林格氏液为水性灌流液,其组成、pH值、渗透压、离子强度与采样部位的内环境接近,故比较适宜于极性成分的采样。CVB-D是一种易溶于有机溶剂而微溶于水的生物碱,其亲脂性较强,容易通过分子问相互作用与微透析膜结合,因此其相对回收率非常低,故有必要采取措施在尽量少影响内环境的前提下增加CVB-D在灌流液中的溶解度,并抑制其与膜的非特异性结合。因此我们选择了加入一些灌流液改性剂,以增加CVB-D的微透析回收率,考察的改性剂有:乙醇、丙三醇、DMSO、β-环糊精。结果表明4.41mMβ-环糊精能显著提高CVB-D的相对回收率。1.3流速对回收率的影响相对回收率RR与灌流液流速之间遵循反指数关系,即:RR=Ed=1-exp（kA/v）上式表明随着灌流速度的增加,RR成指数形式下降。流速对于回收率的影响:作常明显,因此有必要考察流速对回收率的影响。我们考察了流速4、3、2、1、0.5μl/min对回收率的影响,结果显示了相对回收率随流速增加呈指数下降。因此,我们通过采样量、采样时间和在体实验的具体要求选择最佳的流速。1.4相对回率和相对损失率RL之间的关系对于在体动物实验,在动态血药浓度检测过程中,由于无法测得血药浓度,因此在体动物的RR往往很难测得,大量的研究表明RR和RL有着高度的一致性,在进行在体实验的时候可以考虑测定RL来代替RR。结果显示RR和RL在体外有着高度的相关性,为在体实验的时候测定RL来代替RR提供理论基础。1.5探针回收率的稳定性考察考察了探针的稳定性,结果显示体外回收率、体内外相对损失率在研究的时间、浓度范围内保持相对稳定。2环维黄杨星D体外血浆蛋白结合率的测定采用微透析技术测定CVB-D的血浆蛋白结合率,药物在血液中会有部分药物与血浆蛋白结合,结合以后分子量变大,将影响或改变微透析的采样效率,通常,微透析只是检测了血液中游离药物的浓度,因此在进行血液微透析之前有必要考察其血浆蛋白结合率。我们选用了微透析法测定CVB-D大鼠体外血浆蛋白结合率,考察了2.5、5.0、7.5μg/mL的含药血浆下的蛋白结合率,结果显示血浆蛋白结合率在所研究的浓度范围内保持了相对稳定;不同浓度CVB-D—新西兰兔血浆体外血浆蛋白结合率变化不大。3经皮给药制剂的制备根据于洋博士课题《环维黄杨星D经皮给药系统的制备与评价》的研究结果环维黄杨星D贴剂的处方和工艺过程制备贴剂。4 CVD和黄杨宁药物动力学和药效动力学的研究4.1心肌缺血动物模型的建立日前心肌缺血动物模型的制备主要有药物注射法（如垂体后叶素、异丙肾上腺素、麦角新碱等腹腔注射或皮下、静脉注射）,冠状动脉结扎法及电刺激法等。我们选择了多次大剂量的注射异丙肾上腺素形成大鼠心肌缺血模型、冠脉结扎法制备新西兰兔和beagle犬心肌缺血模型,以ST段的偏移值、丙二醛、乳酸脱氢酶和肌酸激酶为效应指标,结果显示,三种方法都能成功制备心肌缺血模型,但是,根据PK-PD模型的需求,选择冠脉结扎法制备心肌缺血模型。4.2 CVB-D和黄杨宁药效动力学研究方法的建立选择新西兰兔为实验动物,冠脉结扎法制备心肌缺血模型,随机分成4组,分为黄杨宁贴片组、黄杨宁口服给药组、环维黄杨星D贴片组和环维黄杨星D口服给药组。观察记录给药后0.5,1,2,3,4,6,8,10,12,16,20h的各项指标,结果显示新西兰兔在冠脉结扎后,心电图ST偏移明显,丙二醛的含量,乳酸脱氢酶和肌酸激酶的活性均有明显升高。6h左右药效达到峰值。口服剂型与贴剂比较发现,达峰时问基本相同,达峰后口服制剂的心电图ST段、丙二醛的含量,乳酸脱氢酶和肌酸激酶的活性上升很快,而贴剂较为平稳。4.3 CVD和黄杨宁药物动力学研究方法的建立选择新西兰兔为实验动物,HPLC法进行生物样品分析,研究了黄杨宁贴剂、黄杨宁口服给药、环维黄杨星D贴剂和环维黄杨星D口服给药的体内药动学行为。采用3p97药动学软件对实验数据分别进行隔室模型和统计距模型处理,结果表明贴剂经皮给药后符合单室模型,血药浓度绝对波动和相对波动结果表明,同口服给药相比,经皮给药可相对避免口服给药带来的血药浓度峰谷波动,维持平稳的血药浓度水平。口服给药后符合二室模型,口服给药的达峰时间明显快与透皮给药的达峰时间。黄杨宁口服与CVB-D口服、黄杨宁贴剂与CVB-D贴剂的各个参数差别都不大,说明黄杨宁口服与CVB-D口服、黄杨宁贴剂与CVB-D贴剂之间的体内药动学行为基本一致。4.4 CVB-D和黄杨宁的PK—PD结合模型的建立药代动力学（pharmacokinetics,PK）,反映了药物在体液中的时间—浓度关系,解释的是“机体对药物处置”的问题;药效学（pharmacodynamics,PD）,反映了效应部位的药物浓度和效应关系,解释的是“药物对机体的作用”的问题。PK-PD联合模型就是结合以上两种方法来描述给某一剂量药物后的药物在体内的浓度-效应-时间之间的统一联系。由描述药物体内时间过程的药动学与描述体内的药物浓度的药物效应变化的药效学两部分组成的。通过药动学与药效学结合模型揭示血药浓度和效应之间的内在联系,以帮助了解药物在体内作用部位的动力学变化过程。由结果可见,黄杨宁贴剂、黄杨宁口服给药、环维黄杨星D贴剂和环维黄杨星D口服给药的血药浓度快于药物效应的达峰时间,存在滞后现象,E～Cp曲线表现为逆时针滞后环,对药物效应进行PK—PD模型拟合后,E～Cp的滞后关系被转化成E～Ce的正变关系,E与Ce的出峰时间相同,E～Ce关系符合Sigmoid-Emax模型。CVB-D和黄杨宁的口服制剂之间、贴剂之间的各个参数比较,相关性较好;口服制剂与贴剂比较,Emax差别较大,口服制剂的Cmax要高于贴剂,贴剂的血药浓度较为平缓。4.5 CVB-D和黄杨宁整体药动学的研究选择新西兰兔为实验动物,采用微透析采样技术,耳缘静脉植入探针,收集透析液,HPLC法进行样品分析,并经相对回收率校正为血液中真实的浓度,采用3p97药动学软件对实验数据分别进行隔室模型和统计距模型处理,结果表明贴剂经皮给药后符合单室模型,口服给药后符合二室模型。