东亚钳蝎镇痛活性肽V的克隆、表达及其结构与功能研究

论文摘要

东亚钳蝎镇痛活性肽V（BmK-MS）的编码基因是由本实验室首次发现。基因序列全长195bp,编码65个氨基酸残基。本实验是根据BmK-MS、BmK-M9的成熟肽编码基因设计引物,将BmK-MS扩增后的目的基因构建入pET-28a（+）质粒载体,进而将重组质粒pET-28a-Tag（His）-MS转入大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE电泳,得出几乎全部表达产物均以包涵体形式存在。然后,构建重组质粒pSYPU-1b-Tag（His）-MS、pSYPU-1b-Tag（His）-M9,实现二者在大肠杆菌中的可溶性表达。然后以构建好的重组质粒pSYPU-1b-Tag（His）-MS、pSYPU-1b-Tag（His）-M9分别转入大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,并分离纯化出可溶性蛋白BmK-MS、BmK-M9。采用金属离子螯合层析、阳离子交换层析的方法,超声破碎已转化的大肠杆菌,从离心后的菌体上清液中分离纯化出重组蛋白Tag（His）-MS、Tag（His）-M9,并且达到电泳纯。通过小鼠醋酸扭体法检定BmK-MS、BmK-M9的镇痛活性,并比较两者镇痛活性差异,以检测第54位氨基酸残基的差异对活性的影响,从而对东亚钳蝎镇痛活性肽V的结构与功能关系进行初步研究。分别采用腹腔注射和尾静脉注射的给药途径,相同给药剂量下（0.1364μmol/kg）,两种蛋白均表现出较高的镇痛活性,其扭体反应抑制率分别为腹腔注射组51.2%、59.1%,尾静脉注射组83.0%、81.7%。实验结果表明,近C末端的突变可能影响镇痛活性,说明近C末端可能对蝎毒素的功能的维持具有一定作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 蝎与蝎毒
• 1.2 蝎毒素的分类
• 1.3 蝎毒的结构与功能研究
• 1.4 蝎毒的镇痛活性研究
• 1.5 立题依据及实验目的
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 动物
• 2.1.4 层析填料
• 2.1.5 实验仪器
• 2.2 实验方法
• His-MS的构建'>2.2.1 表达质粒pET-28a-Tag_His-MS的构建
• His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的构建'>2.2.2 表达质粒pSYPU-1b-Tag_His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的构建
• His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的分离纯化'>2.2.3 重组蛋白pSYPU-1b-Tag_His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的分离纯化
• 2.2.4 镇痛活性检测
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 实验结果
• His-MS的构建'>3.1.1 表达质粒pET-28a-Tag_His-MS的构建
• His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的构建'>3.1.2 表达质粒pSYPU-1b-Tag_His-MS、pSYPU-1b-Tag_His-M9的构建
• 3.1.3 Chelating Sepharose Fast Flow柱层析及电泳分析结果
• 3.1.4 阳离子交换层析SP Sepharose Fast Flow的分离纯化及电泳结果
• His-MS、Tag_His-M9的镇痛活性测定'>3.1.5 重组蛋白Tag_His-MS、Tag_His-M9的镇痛活性测定
• 3.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢