论文摘要
蓝舌病（Bluetongue, BT）是一种经吸血昆虫传播,引起反刍动物疫病的急性病毒性传染病,是世界动物卫生组织（OIE）规定的上报疾病（以前为A类传染病）,我国将其列为一类动物疫病。蓝舌病对动物和动物制品国际间贸易具有非常重要的影响,国际组织和各国政府均将其列为动物疫病监测和防控的重点。其病原还是人用动物源生物制品（如人用牛源凝血酶、凝血因子Ⅷ、聚合牛血红蛋白、胸腺肽、羊胎盘素）和生物制品敷料（如牛血清、牛肉浸膏、牛源明胶、牛源胶原）病毒安全性检测的病毒之一。蓝舌病的病原是蓝舌病病毒（Bluetongue virus, BTV）,为呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）成员,至少存在24个血清型,呈全球性分布。随着全球气温变暖,2006年～2008年欧洲许多国家爆发蓝舌病,使其分布范围不断扩张,并出现了地域性新血清型。目前,世界各国尚无十分有效的蓝舌病预防疫苗,还无有效的防治措施,为了能有效地监测和控制蓝舌病,有必要建立快速可靠、适于各血清型BTV特异性通用核酸检测技术,并研制相应的检测试剂盒。本研究利用计算机软件、网络数据库以及在线软件等生物信息学手段,获取不同血清型蓝舌病病毒的不同保守基因序列,通过序列比对、同源性分析等找到了一段最保守的基因片段作为通用型BTV核酸检测靶标,根据该基因检测靶标,设计了适于BTV群特异性通用检测的1对引物和1条TaqMan荧光探针,对其分别进行了特性分析和同源性分析等,结果显示,该引物和荧光探针序列均具有良好的特异性,与其他病毒序列未发现有同源性。将引进的BTV-1～22标准参考株、鹿流行性出血热病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV）-5标准参考株,分别接种BHK-21细胞,通过细胞病变效应（CPE）、纯化病毒形态观察和抗原ELISA检测方法进行鉴定,建立了BTV阳性参比品、EHDV阴性参比品。利用分子生物学技术制备了重组质粒、体外转录RNA,通过鉴定后建立了相应的重组质粒DNA阳性参比品、体外转录RNA阳性参比品。利用DEPC水作为空白阴性参比品。利用所设计的特异性引物和制备的阳/阴性参比品建立了BTV RT-PCR检测技术,并进行了RT-PCR核酸检测体系的优化试验,确定了适宜的检测体系。通过特异性试验、灵敏度试验、重复性试验、符合率试验、消长规律试验、血清样品检测试验、稳定性试验等对BTV通用型RT-PCR核酸检测试剂进行评价和验证。结果显示,（1）该RT-PCR检测试剂的特异性好,对15份阴性样品检测的阴性率为100%,与亲缘关系最近的同属病毒EHDV无交叉反应,与6种牛羊常见感染病毒无交叉反应。（2）敏感性好,对20份模拟BTV感染的血清样品进行检测,阳性率为100%,对20份BTV阳性样品检测的阳性率为90%,最低检出量为102copies RNA分子、1TCID50/mL BTV。（3）重复性好,对强阳性、临界阳性、阴性参比品分别进行重复检测,阳/阴性定性检出率的百分率为100%。（4）符合率试验中,建立了BTV核酸检测的同类方法（双重RT-PCR）,利用BTV RT-PCR核酸检测方法与其同类方法对BTV-1～22、EHDV-5共23份标准参考毒株分别进行检测,符合率达95.65%,结果显示,我们所建立的BTV RT-PCR通用核酸检测方法可检出22个血清型BTV,而双重RT-PCR仅检出21个血清型BTV,EHDV-5检测结果均为阴性。（5）消长规律试验中,BTV RT-PCR检测试剂可检出经72h培养的阳性标准参考毒株。（6）对40份羊血清样品进行检测,结果与商品化的荧光标记抗体-BTV直接检测试剂盒检测结果一致,显示检测结果可靠。（7）确定了该BTV RT-PCR核酸检测试剂的保存条件和有效期为-20℃,6个月。通过BTV RT-PCR核酸检测试剂盒的临床前试验情况,制定了《蓝舌病病毒RT-PCR核酸检测试剂盒制造及检验试行规程（草案）》、《质量标准（草案）》、《起草说明》、《使用说明书》、《标签样稿》等。根据制定的《试行规程（草案）》等,完成了5批蓝舌病病毒RT-PCR核酸检测试剂盒的中试,检验结果合格。制定了相应的临床试验方案,签订了临床试验协议。按照国家有关部门规定和要求撰写《蓝舌病病毒RT-PCR核酸检测试剂盒临床试验申请资料》,向国家农业部提交临床试验申请,已经受理并获得临床试验批文。利用设计的TaqMan荧光探针、特异性引物以及制备的阳/阴性参比品建立了BTV RT-荧光定量PCR检测技术,通过优化试验确定了BTV通用型RT-荧光定量PCR核酸检测体系。分别利用特异性、灵敏度、重复性、符合率、消长规律、血清样品检测、稳定性等试验对该BTV群特异性RT-荧光定量PCR核酸检测试剂进行各项评估。试验结果表明,（1）通用型BTV RT-荧光定量PCR检测体系的特异性良好,对15份阴性样品检测阴性率为100%,与EHDV和牛羊常见感染病毒无交叉反应,与有关单位验证结果一致。（2）该RT-荧光定量PCR检测体系的敏感性好,检测20份BTV模拟血清样品的阳性率为100%,检测20份BTV阳性样品的阳性率为95%,对体外转录RNA参比品的最低检出量为102copies,对BTV阳性参比品的检出量为1TCID50/mL。（3）检测重复性好,对强阳性参比品重复检测扩增曲线Ct值的批内CV值分别为2.17、2.18、3.66,批间CV%为3.23,对临界阳性参比品检测,Ct值的批内CV值分别为2.96、4.96、4.43,批间CV值为4.04,对阴性参比品进行检测,Ct值的批内和批间CV值为0;对BTV-1进行5次重复检测,Ct值的CV为5.6。（4）符合率试验中,利用BTV RT-荧光定量PCR方法和BTV双重RT-PCR核酸检测方法对BTV-1～22、EHDV-5共23份标准毒株进行检测,结果本研究建立的RT-荧光定量PCR检测方法可检出22个血清型BTV,双重RT-PCR方法仅检出21个血清型BTV,符合率为95.65%。（5）消长规律试验结果显示,通用型BTV RT-荧光定量PCR检测试剂对36h培养BTV-8、48h培养的BTV-1标准参考株检测结果呈阳性。（6）利用BTV RT-荧光定量PCR核酸检测试剂和商品化的荧光标记抗体-BTV直接检测试剂盒对40份羊血清样品进行检测,结果一致。（7）通过稳定性试验,确定了BTV RT-荧光定量PCR检测试剂的保存条件-20℃,有效期为6个月。结合BTV群特异性RT-荧光定量PCR检测试剂的实验室研究结果,制定了《蓝舌病病毒RT-荧光定量PCR核酸检测试剂盒制造及检验试行规程（草案）》、《质量标准（草案）》、《起草说明》、《使用说明书》、《标签样稿》等。进行了5批产品的中试,检验合格。制定了临床试验方案,并签订了临床试验协议,按照有关部门规定和要求撰写了《蓝舌病病毒RT-荧光定量PCR核酸检测试剂盒临床试验申请资料》,向国家农业部提交临床试验申请,已经受理并获得临床试验批文。结论:顺利完成了蓝舌病病毒RT-PCR核酸检测试剂盒、蓝舌病病毒RT-荧光定量PCR检测试剂盒的临床前研究,分别进行了5批产品的中试,检验合格,均获得了国家农业部的临床试验批件,为临床试验的进一步开展奠定了基础。
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