犬瘟热病毒磷蛋白基因的遗传进化分析及其原核表达

论文摘要

【目的】本研究以两株犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）为研究对象,就其磷蛋白基因与GenBank中注册的十种不同毒株的磷蛋白基因进行遗传进化分析,以期为犬瘟热（Canine distemper,CD）分子流行病学调查和防制措施研究提供科学依据。同时,以犬源CDV磷蛋白基因原核表达,旨在为建立CD快速、简便、特异的诊断方法及其基因工程疫苗研制奠定实验基础。【方法】本实验以CDV基因组RNA为模板进行磷蛋白基因的RT-PCR扩增、克隆和测序,应用DNAStar和Mega（version3.1）分析软件对两株CDV与GenBank中的十种不同毒株CDV磷蛋白基因的核苷酸序列及推导氨基酸序列进行同源性和系统进化关系分析。应用DNA重组技术,构建犬源CDV磷蛋白基因的原核表达系统,以SDS-PAGE、间接ELISA和Western blot方法鉴定表达产物的免疫活性。【结果】研究显示,虎源和犬源CDV毒株磷蛋白基因序列与GenBank中的10种不同毒株的磷蛋白基因序列AY466011、AY964113、AF181446、AY386315、AF259549、AJ582385、AB212727、AB212962、AY130857和U53712的一段387bp保守核苷酸序列同源性分别为93%和96%、95%和95%、93%和99%、91%和94%、91%和94%、95%和96%、94%和96%、96%和98%、98%和97%、93%和95%。核苷酸序列比对分析发现12株病毒的磷蛋白基因保守序列上有6个核苷酸变异,其中2243C和2465A仅见于虎的序列及序列AY466011和AY130857,种系进化分析也显示三者的亲缘关系最近,表明2243位、2465位的核苷酸突变可能与犬瘟热病毒种间传播存在某种关系。成功获得犬源CDV磷蛋白基因重组菌,于37℃用1.0mmol/L IPTG诱导6h后表达大小约为92ku的融合蛋白,纯化融合蛋白经Western-blot和间接ELISA检测,可与抗CDV多克隆抗体发生特异性反应,表明获得重组磷蛋白。【结论】12株CDV的磷蛋白基因保守序列区有6个核苷酸变异,该基因保守区遗传进化分析显示虎源与浣熊源（AY466011）、貂源（AY130857）毒株间存在较近的亲缘关系。成功地构建了CDV磷蛋白基因的原核表达系统,获得了重组磷蛋白。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩写词英汉对照表
• 第一章 绪论
• 1 犬瘟热的研究现状
• 1.1 犬瘟热的概述
• 1.2 犬瘟热与变形性骨炎的关系
• 1.2.1 变形性骨炎的概况
• 1.2.2 CDV 与变形性骨炎的关系
• 1.3 CDV 的分子生物学特性
• 1.3.1 CDV 的形态和理化特性
• 1.3.2 CDV 基因组结构特点
• 1.3.3 分子流行病学特点
• 1.4 CDV 检测方法研究
• 1.5 犬瘟热基因工程度苗研究进展
• 1.6 展望与思考
• 2 研究的目的和意义
• 3 研究的内容和方法
• 第二章 CDV 磷蛋白基因的遗传进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株、细胞
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 犬源CDV 培养
• 1.2.2 CDV 的鉴定
• 1.2.3 虎源和犬源CDV 的RNA 提取
• 1.2.4 引物的设计与合成
• 1.2.5 cDNA 第一链的合成
• 1.2.6 反转录产物的PCR 扩增体系
• 1.2.7 磷蛋白基因的克隆及鉴定
• 1.2.8 CDV 磷蛋白基因的序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 犬源CDV 感染Vero 细胞的病变特征
• 2.2 犬源CDV 鉴定
• 2.2.1 血凝试验结果
• 2.2.2 血凝抑制试验结果
• 2.3 磷蛋白基因的RT-PCR 扩增
• 2.4 阳性克隆鉴定
• 2.4.1 PCR 方法鉴定
• 2.4.2 测序鉴定
• 2.5 CDV 磷蛋白基因序列的同源性分析
• 2.6 磷蛋白基因序列变异分析
• 2.7 系统遗传进化分析
• 3 讨论
• 第三章 犬源 CDV 磷蛋白基因的原核表达及其产物鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、实验动物
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 重组表达质粒pGEX-4T-1-P 的构建
• 1.2.3 重组质粒的诱导表达
• 1.2.4 融合蛋白的纯化
• 1.2.5 表达产物的Western-blot 检侧
• 1.2.6 重组磷蛋白间接ELISA 方法的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 重组表达载体的鉴定
• 2.1.1 PCR 方法鉴定
• 2.1.2 酶切鉴定
• 2.2 表达产物SDS-PAGE 分析
• 2.3 表达产物的Western-blot 分析
• 2.4 表达产物的间接ELISA 检测
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介