联合应用选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398和脂氧合酶抑制剂NDGA对人肝癌细胞株HepG-2增殖及凋亡的影响

论文摘要

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,近二十年来,我国HCC的死亡率增加了41.7%,约占全世界HCC死亡人数的42%。目前,手术切除仍是治疗HCC的最佳手段,但本病起病隐匿,病情发展迅速,大多数患者就诊时已发展到中晚期,失去了手术治疗的机会,患者5年生存率低于10%。环氧合酶（cylooxygenases,COX）和脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）是体内催化花生四烯酸（arachidonic acid, AA）代谢的两个关键酶。细胞膜上的磷脂在磷脂酶A2作用下释放出AA,AA经COX和LOX两条通路代谢产生一系列的生物活性物质,如前列腺素（PG）、血栓烷素A2 （TXA2）、羟基廿碳四烯酸（HETES）和白细胞三烯（LTS）等。通过这些活性物质,COX及LOX影响细胞信号转导及代谢,进而对包括肿瘤,炎症在内的多种疾病产生作用。NS-398是一种选择性COX-2抑制剂,与传统的非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDS）不同的是其抑制COX-1的作用非常弱,从而减轻了胃肠道的不良反应。目前其已被发现能够抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞周期阻滞。LOX抑制剂NDGA对于人肝癌细胞株HepG2细胞具有明显生长抑制作用,同时还可以诱导HepG2细胞凋亡,引起细胞周期被阻滞于G1/S期。本研究选用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,探讨NS-398和NDGA联合应用对人肝癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及对bcl-2mRNA表达的影响,为将NS-398和NDGA联合应用于HCC的治疗提供初步的实验依据。目的:探讨单独和联合应用选择性环氧合酶-2抑制剂（cyclooxygenase-2 selective inhibitor） NS-398和脂氧合酶抑制剂（lipoxygenase inhibitor）NDGA对于人肝癌细胞株HepG2的增殖、凋亡和对bcl-2mRNA表达的影响。方法:（1）采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测单独及联合应用NS-398和NDGA对于人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用并应用金正均法判断两药的相互作用。（2）采用DNA末端原位标记染色法（TUNEL法）观察药物作用后人肝癌细胞株HepG2的形态学改变并计算凋亡指数（apoptosis index, AI）。（3）采用流式细胞术检测药物作用后人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡率。（4）采用RT-PCR检测药物作用后人肝癌细胞株HepG2中bcl-2 mRNA的表达。结果:（1） MTT结果显示NS-398 （20160μmol/L）或NDGA （25200μmol/L）单独应用对人肝癌细胞株HepG2均有增殖抑制作用,药物浓度越高,抑制作用越强,呈现明显的剂量效应关系。系列浓度NS-398或NDGA作用于细胞24h、48h、72h后观察细胞的生长情况,结果显示NS-398或NDGA作用时间越长,对上述细胞的抑制作用越强,呈明显的时间效应关系。依据金正均法NS-398在20160μmol·L-1浓度范围内与NDGA 25100μmol·L-1浓度范围内及NS-398 20μmol·L-1与NDGA 200μmol·L-1联合应用显示出协同作用（q >1.15）,余浓度联合应用显示相加作用（0.85<q<1.15）。联合用药组与同等剂量NDGA各单独用药组相比差异具有显著性（*P<0.05,**P<0.01）。（2） TUNEL染色结果显示经NS-398（160μmol/L）和NDGA（200μmol/L）单独和联合应用48h后均可诱导人肝癌细胞株HepG2发生凋亡,凋亡细胞胞核成棕色,核固缩,大小不一;非凋亡细胞细胞核淡蓝紫色,核形态大小较一致。联合用药组较各单独用药组及对照组凋亡指数增高。（3）流式细胞术结果显示经NS-398（160μmol/L）和NDGA（200μmol/L）单独和联合应用48h后均可诱导人肝癌细胞株HepG2发生凋亡,在DNA直方图上G0/G1期前可见亚G1峰即凋亡峰,NS-398与NDGA联合应用48h后凋亡率明显高于各单独用药组,提示两药合用对诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡有协同作用。（4） RT-PCR检测bcl-2 mRNA的结果显示NS-398（160μmol/L）或NDGA（200μmol/L）单独和联合用药48h后HepG2细胞bcl-2 mRNA的表达均降低,两药联合用药组人肝癌HepG2细胞bcl-2 mRNA表达明显低于NS-398或NDGA单独用药组,差异具有显著性（**P<0.01）。结论:（1）单独应用NS-398或NDGA对于人肝癌细胞株HepG2均有增殖抑制作用,且呈剂量和时间效应关系。NS-398和NDGA联合用药对人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制具有协同作用。（2）单独应用NS-398或NDGA对于人肝癌细胞株HepG2均有诱导凋亡作用; NS-398和NDGA联合用药对于人肝癌细胞株HepG2有协同诱导凋亡作用,并可能与抑制bcl-2 mRNA表达的作用增强有关。

论文目录

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• 正文
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献