大鼠肝脏线粒体的体外功能评价及对其损伤与保护的研究

论文摘要

目的:通过五个指标（线粒体呼吸功能、线粒体通透性孔道、线粒体膜电位、线粒体活力以及线粒体超氧自由基）评价分离制备的大鼠肝脏线粒体功能,探索银杏酸和阿霉素对肝脏线粒体的损伤效应与作用机制,并筛选防治这类损伤的药物。方法:1.肝脏线粒体的制备与质量评估:采用分步差速离心法制备大鼠肝脏线粒体。以线粒体呼吸功能和胞浆、线粒体标志酶（乳酸脱氢酶和柠檬酸合酶）活性来评估线粒体制备质量。2.肝脏线粒体的功能评估:（1）线粒体呼吸功能的测定（采用Clark氧电极法）（2）线粒体通透性孔道肝放的测定（采用分光光度法）（3）线粒体膜电位的测定（采用Rhodamine 123荧光法）（4）线粒体活力测定（采用MTT法）（5）线粒体超氧自由基生成的测定（采用NBT法）3.借助上述指标,观察银含酸及阿霉素对大鼠肝脏线粒体功能的损伤作用。4.借助上述指标,观察辅酶Q10、地高辛和银杏叶提取物对GA13和阿霉素所致大鼠肝脏线粒体功能损伤的保护作用。结果:1.线粒体的功能评价（1）呼吸功能和标志酶（LDH/CS）活性的测定确保了所制得的线粒体相对富集、功能完好,可供本研究的各项指标测定使用。（2）线粒体制备后8小时内功能可以保持完好。（3）通过五个指标（线粒体呼吸功能、线粒体通透性孔道、线粒体膜电位、线粒体活力以及线粒体超氧自由基）和各类线粒体工具药,较为全面地评价了分离制备的大鼠肝脏线粒体的功能。本研究将测定细胞活力的MTT法移植于直接测定线粒体活力,取得了良好的效果。还通过NBT法为检测线粒体超氧自由基提供了简便、灵敏的方法。这些研究为线粒体体外功能评价平台的建立奠定了良好的基础。2.GA对线粒体的损伤作用（1）GA可剂量依赖性地抑制线粒体的呼吸功能,并显示对氧化磷酸化有解偶联作用。（2）GA13和GA15可剂量依赖性地诱导mPTP的开放(EC50值分别为2.75μM和3.20μM),且均被CysA特异性抑制,提示GA所导致的mPTP开放作用位点很可能在环亲和素D（cyclophilin-D）。（3）GA13和GA15可剂量依赖性地破坏肝脏线粒体膜电位,其IC50值分别为3.58μM和3.79μM。（4）GA13和GA15可剂量依赖性地抑制线粒体活力（MTT信号）,其IC50值分别为9.77μM和7.61μM。（5）通过上述实验,本研究首次系统阐明了GA对肝脏线粒体的损伤作用及其机制。3.阿霉素对线粒体的损伤作用（1）阿霉素在体外对线粒体的呼吸功能造成较为明显的损伤作用,主要表现在Ⅳ态呼吸速率提高、RCR值和ADP/O值降低。（2）阿霉素可剂量依赖性地诱导mPTP开放,其EC50值为57.4μM;但其效应相对弱于钙离子。2μM CysA对阿霉素诱导的mPTP开放只能产生50%左右的抑制,表明阿霉素诱导的mPTP开放还存在其他机制。（3）阿霉素具有破坏线粒体膜电位的作用,其IC50值为7.32μM。（4）通过上述实验,本研究在线粒体层面探索了阿霉素的毒性作用机制,为防治阿霉素造成的毒副作用提供了重要线索。4.CoQ10对GA13和阿霉素所致线粒体损伤的保护作用本研究通过上述线粒体功能指标,评估了三种药物(CoQ10、地高辛及GBE)对GA和阿霉素造成的线粒体功能损伤的作用,发现:（1）CoQ10能剂量依赖性地抑制GA13对线粒体呼吸功能的损伤。（2）CoQ10能剂量依赖性地抑制阿霉素对线粒体呼吸功能的损伤。结论:1.本研究通过对线粒体五个方面（呼吸功能、通透性孔道、膜电位、线粒体活力以及超氧自由基生成）的功能测定,较为完整地反映了线粒体的功能。2.本研究首次系统阐明了GA对肝脏线粒体的损伤作用及其机制。3.本研究在线粒体层面探索了阿霉素的毒性作用机制,为防治阿霉素造成的毒副作用提供了重要线索。4.本研究通过对三种药物的筛选,发现CoQ10可有效抑制GA和阿霉素造成的线粒体呼吸功能损伤,为进一步研究该药对这类损伤的防治和临床应用奠定了基础。

论文目录

• 缩略语中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 线粒体在细胞生物学中的地位
• 1.2 线粒体与疾病的关系
• 1.3 以线粒体为靶点的药物研发
• 1.4 线粒体的体外功能评价
• 1.5 选择肝脏线粒体作为研究载体
• 1.6 银杏酸的研究背景
• 1.7 阿霉素的研究背景
• 2.实验方法
• 2.1 线粒体制备
• 2.2 线粒体制备质量的评估
• 2.2.1 线粒体呼吸功能的测定
• 2.2.2 胞浆与线粒体标志酶的活性测定
• 2.3 线粒体的功能评价
• 2.3.1 线粒体呼吸功能的测定
• 2.3.2 线粒体通透性孔道（mPTP）开放的测定
• m）的测定'>2.3.3 线粒体膜电位（△ψ_m）的测定
• 2.3.4 线粒体活力测定（MTT法）
• 2.3.5 线粒体超氧自由基测定（NBT法）
• 2.4 药品与试剂
• 2.4.1 银杏酸单体的制备
• 2.4.2 其他药品与试剂
• 2.5 统计学处理
• 3.结果
• 3.1 线粒体的功能评价
• 3.1.1 线粒体制备质量的评估
• 3.1.1.1 呼吸功能的测定
• 3.1.1.2 标志酶（LDH和CS）的活性测定
• 3.1.1.3 制备线粒体功能维持时间的评价
• 3.1.1.3.1 线粒体的呼吸功能
• 3.1.1.3.2 钙离子诱导的线粒体通透性孔道开放
• 3.1.1.3.3 线粒体膜电位
• 3.1.1.3.4 线粒体活力
• 3.1.1.3.5 线粒体超氧自由基生成
• 3.1.2 线粒体的呼吸功能测定
• 3.1.2.1 呼吸链阻断剂对呼吸功能的作用
• 3.1.2.2 解偶联剂对呼吸功能的作用
• 3.1.2.3 ATP合成酶抑制剂对呼吸功能的作用
• 3.1.3 线粒体通透性孔道开放的测定
• 3.1.3.1 钙离子诱导的线粒体通透性孔道开放
• 3.1.3.2 环孢素A对线粒体通透性孔道开放的抑制
• 3.1.4 线粒体的膜电位测定
• 3.1.4.1 Rhodamine 123的浓度与其荧光强度的关系
• 3.1.4.2 与呼吸链相关的药物对线粒体膜电位的作用
• 3.1.4.3 解偶联剂CCCP对线粒体膜电位的作用
• 3.1.5 线粒体的活力测定（MTT法）
• 3.1.5.1 不同呼吸底物对MTT信号的作用
• 3.1.5.2 与呼吸链相关的工具药对MTT信号的作用
• 3.1.6 线粒体超氧自由基的测定（NBT法）
• 3.1.6.1 不同呼吸底物对NBT信号的作用
• 3.1.6.2 与呼吸链相关的工具药对NBT信号的作用
• 3.1.6.3 外周血SOD提取液对NBT信号的作用
• 3.2 GA13和GA15对线粒体功能的影响
• 3.2.1 GA13和GA15对线粒体呼吸功能的影响
• 3.2.2 GA13和GA15对线粒体通透性孔道开放的影响
• 3.2.3 GA13和GA15对线粒体膜电位的影响
• 3.2.4 GA13和GA15对线粒体活力的影响
• 3.2.5 GA13和GA15对NBT信号的影响
• 3.3 阿霉素对线粒体功能的影响
• 3.3.1 阿霉素对线粒体呼吸功能的影响
• 3.3.2 阿霉素对线粒体通透性孔道开放的影响
• 3.3.3 阿霉素对线粒体膜电位的影响
• 3.4 CoQ10、地高辛及GBE对GA13造成的线粒体功能损伤的影响
• 3.4.1 对线粒体呼吸功能的作用
• 3.4.2 对线粒体通透性孔道开放的作用
• 3.4.3 对线粒体膜电位的作用
• 3.4.4 对线粒体活力的作用
• 10、地高辛及GBE对阿霉素造成线粒体功能损伤的作用'>3.5 CoQ₁₀、地高辛及GBE对阿霉素造成线粒体功能损伤的作用
• 3.5.1 对线粒体呼吸功能的作用
• 3.5.2 对线粒体通透性孔道开放的作用
• 3.5.3 对线粒体膜电位的作用
• 4.讨论
• 4.1 实验结果的综合分析
• 4.1.1 线粒体的功能评价
• 4.1.2 GA对线粒体的损伤作用
• 4.1.3 阿霉素对线粒体的损伤作用
• 10对GA13和阿霉素所致线粒体损伤的保护作用'>4.1.4 CoQ₁₀对GA13和阿霉素所致线粒体损伤的保护作用
• 4.2 线粒体功能评价方法的考察与进展
• 4.2.1 线粒体的制备
• 4.2.2 线粒体呼吸功能的测定
• 4.2.3 线粒体通透性孔道开放的测定
• 4.2.4 线粒体膜电位的测定
• 4.2.5 线粒体活力的测定
• 4.2.6 线粒体超氧自由基的测定
• 4.3 本研究的不足之处与今后研究的目标
• 5.小结
• 6.参考文献
• 附1.论文发表情况及所获奖励
• 附2.综述
• 附3.致谢