Beta淀粉样肽诱导人成神经瘤母细胞凋亡分子机制的初步探讨

论文摘要

β淀粉样肽（Aβ）是由42个氨基酸组成的肽(Aβ1-42),它是其前体蛋白（APP）剪切后的产物。Aβ以一种不可溶解的沉积物形式积聚在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者大脑神经元的周围。增加的Aβ沉积物形式通过诱导神经元的死亡,进而改变AD的病理生理状态包括行为和认知方面的改变。已有报道神经元的细胞凋亡、钙稳态的失调和氧化胁迫与Aβ的神经毒性作用有关。但是有关Aβ神经毒性作用的机制尚未被研究透彻。人成神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞是一个较好的神经元模型,它已被广泛用于建立AD模型,本实验利用功能基因组学、蛋白质组学和药理基因组学技术,如高密度基因芯片技术、实时荧光定量PCR技术、二维液相色谱技术、RNAi和免疫印迹技术分析研究Aβ诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制。1.β-淀粉样肽（1-42）诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡的基因表达谱分析Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞。使用CCK-8对细胞活力进行测定。利用Hoechst33342和Annexin-Cy5/Calcein标记的方法,对细胞凋亡进行鉴定。利用安捷伦基因芯片进行表达谱分析。结果显示Aβ1-42以一种浓度依赖性的方式抑制细胞生长,同时能够诱导细胞发生凋亡。芯片分析和实时荧光定量PCR结果显示Aβ1-42处理细胞后,有46个基因的表达水平发生变化,其中包括Caspase-2、Caspase-3、Bax、TP53和TRAF1等基因。2.β-淀粉样肽（1-42）诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中的蛋白谱表达差异分析为了进一步从蛋白水平分析Aβ1-42诱导神经元细胞凋亡的机制,本实验利用美国Beckman公司的ProteomeLabTM PF 2D Protein Fractionation System对Aβ1-42处理24小时前后的SH-SY5Y细胞进行蛋白表达差异的分析。结果显示有72个蛋白的表达水平发生变化,并利用MALDI-TOF-MS（matrix assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）鉴定出了三个蛋白包括组蛋白、真核翻译起始因子（eIF-5A）和蛋白质二硫键异构酶（PDIA6）。3.Caspase-2和TP53在β-淀粉样肽（1-42）诱导神经瘤母细胞凋亡过程中的作用我们发现在SH-SY5Y细胞中,Aβ1-42能够诱导Caspase-2和TP53的mRNA表达水平的增加,但是有关这两个与细胞凋亡相关的基因在Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用机制尚需进一步研究。本实验利用转染外源Caspase-2或Caspase-2特异性的siRNA分别过表达Caspase-2或降低Caspase-2的表达;同时利用TP53特异性的抑制剂pifithrin-α和它的siRNA分别降低其蛋白活性和表达水平,从而研究Caspase-2和TP53在Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中的作用。结果表明,过表达Caspase-2诱导SH-SY5Y细胞凋亡,但并没有增强Aβ1-42诱导的细胞凋亡;而抑制Caspase-2的表达并不能抑制Aβ1-42诱导的神经元性细胞凋亡。同时TP53活性被抑制或表达水平被降低也不能抑制Aβ1-42诱导的神经元性细胞凋亡。Aβ1-42增加Bax/Bcl-xl的比例和Caspase-3的表达,然而,在降低Caspase-2表达水平的时候,同时将TP53的表达水平降低或者抑制其蛋白活性时,Aβ1-42诱导的神经元性细胞凋亡能够被完全抑制。以上结果显示,Caspase-2和TP53是Aβ1-42诱导细胞凋亡过程中的关键调节者。4.突变重组人胰高血糖素样肽-1抑制β淀粉样肽1-42诱导的细胞凋亡治疗阿尔茨海默病的选择的靶点之一是阻止β淀粉样肽（Aβ）引发的一系列的生物化学级联反应的发生。已有研究显示胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是肠道分泌的一种内生性的促胰岛素释放肽,它能够与脑中的受体结合并具有神经保护效应。利用定点突变和基因重组的技术,我们得到了人突变重组的GLP-1（mGLP-1）。与天然GLP-1受体激动剂相比,这种突变重组的GLP-1呈现出较长的半衰期。本文旨在研究mGLP-1对β淀粉样肽1-42(Aβ1-42)细胞毒性的影响并探讨其可能的机制。结果显示:当mGLP-1使用浓度在0.02ng/ml以上时能够促进SH-SY5Y细胞增殖,同时0.1ng/ml mGLP-1和0.5ng/ml的mGLP-1能够降低Aβ1-42诱导的细胞凋亡。同时发现Aβ1-42能够明显引发SH-SY5Y细胞内钙库中的钙离子外流,而mGLP-1有助于维持细胞内钙稳态。Aβ1-42能够显著诱导SH-SY5Y细胞内TP53和Bax的表达,已有报道表明这两个基因参与细胞凋亡过程,而mGLP-1降低Aβ1-42上调TP53和Bax表达的水平。在SH-SY5Y细胞中mGLP-1能够升高细胞质内cAMP浓度,我们鉴定mGLP-1可能通过与细胞中的GLP-1受体相结合从而产生cAMP,最后发挥作用。5.溶血磷脂酰胆碱对β淀粉样（1-42）肽诱导神经细胞凋亡的影响许多研究发现脂质平衡态的紊乱在AD发生过程中具有显著的影响作用。同时β淀粉样肽能够引起脂质过氧化反应。但是对于脂质过氧化反应产物和Aβ1-42诱导神经元凋亡之间的关系还有待于研究。本实验的目的是要研究脂质过氧化的一个产物溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞死亡的影响。实验结果显示长时间用LPC处理SH-SY5Y细胞能够增强Aβ1-42的神经毒性作用。Aβ1-42上调Bax/Bcl-xl的比例,同时增加Caspase-3 mRNA和蛋白水平的表达,Caspase-3的蛋白活性也增加,而TRAF1的mRNA表达水平却被下调。当使用LPC和Aβ1-42同时处理SH-SY5Y细胞时,LPC能够增强Aβ1-42对这些基因表达的影响。已有报道LPC是一个孤儿G蛋白偶联受体G2A的一个特异性配体,所以我们研究LPC对SH-SY5Y细胞内钙离子浓度水平的影响。实验结果显示LPC能够增强Aβ1-42诱导的细胞内钙离子浓度增加的程度。此外,我们发现Aβ1-42能够显著增加SH-SY5Y细胞内G2A的表达,同时当G2A的表达被特异的siRNA抑制时,LPC对Aβ1-42的神经毒性的影响也降低。这些实验结果表明LPC可能通过孤儿G蛋白偶联受体的信号途径影响Aβ1-42诱导的细胞凋亡。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 第一章 淀粉样肽（1-42）诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡的基因表达谱分析
• 摘要
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 版图与说明
• 第二章 β-淀粉样肽（1-42）诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中的蛋白谱表达差异分析
• 摘要
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 版图与说明
• 第三章 Caspase-2和TP53在β-淀粉样肽（1-42）诱导神经瘤母细胞凋亡过程中的作用
• 摘要
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 版图与说明
• 第四章 突变重组人胰高血糖素样肽-1抑制β淀粉样肽1-42诱导的细胞凋亡
• 摘要
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 版图说明
• 第五章 溶血磷脂酰胆碱对β淀粉样（1-42）肽诱导神经细胞凋亡的影响
• 摘要
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 版图说明
• 第六章 综述
• 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）和细胞凋亡
• 细胞凋亡中的Caspase
• Caspase和阿尔茨海默病
• Caspase-2:一种特殊的半胱天冬酶
• 参考文献
• 已/待刊文章
• 致谢