生物转化制备L-丝氨酸的研究

论文摘要

本文对生物转化生产L-丝氨酸进行了研究。研究的主要内容包括菌种分离鉴定,耐受性和抗性突变株的选育以及培养基、发酵条件和转化条件的优化。主要研究结果如下:从甲醇污染土壤中筛选分离得到一株产丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的甲基营养型菌株ML206,SHMT活力达到0.0302 U/mL,ML206的生长特性稳定,为一株良好的产SHMT出发菌。对菌株ML206菌落和细胞形态进行观察,对其生理生化特性进行了研究。将ML206菌株的16S rDNA序列和GenBank数据库中已报道的16S rDNA序列进行Blast比对分析,结合形态特征和生理生化特性鉴定结果,确定ML206为嗜胺甲基杆菌。以甲醇、甘氨酸、磺胺胍（SG）三种可提高菌株的L-丝氨酸生产能力的耐受性和抗性药物作为筛子,通过硫酸二乙酯和亚硝基呱诱变手段最终得到突变株ML216（Methanolr,Glyr,SGr）。突变株的SHMT活力由原来的0.0302 U/mL提高到0.0467 U/mL,酶活提高了54.6 %。在Plackett-Burnlan实验的基础上,通过响应曲面法对培养基和发酵条件中的主要影响因子进行优化与评价,结合非显著影响因子水平值可知,在各因素分别为:（NH4）2HPO4 8.6 g/L、FeSO4·7H2O 38 mg/L、甲醇2.2 %和转速205 r/min时,可获得SHMT活力的最大值。在此条件下再进行验证实验,SHMT活力从0.0467 U/mL提高到0.0562 U/mL,较原来提高了20.3 %。把培养基中添加甲醇发酵改为发酵过程中流加甲醇发酵,ML216的发酵时间由72 h减少到50 h。最终,通过优化酶活水平达到0.0612 U/mL,较原来提高了31.0%,菌体浓度提高了133.3 %,发酵时间减少了30.6 %,较大的提高了生产效率。根据纸层析法原理,调整展开剂成分,成功的改进了纸层析定性定量转化体系中的L-丝氨酸的方法。利用该研究中确立的展开剂（正丁醇:丙酮:水:氨水=100:40:38:2）,对转化体系中的L-丝氨酸进行很好的分离。纸层析法相对氨基酸分析仪测定结果在一定范围内标准偏差为0.015～0.028,变异系数最大值为1.65 %,两种方法的相符率达到99.6 %～100.4 %之间。根据不同pH条件下SHMT活力可知,在此转化体系中SHMT的最适pH为8.5。不同温度条件下SHMT的活力大小表明SHMT的最适温度为30℃。对转化体系中甘氨酸添加量和甲醇浓度进行了优化,甘氨酸添加量为8 %,甲醇浓度为2.5%时,产酸最高。在转化体系中添加25μmol/L的磷酸吡多醛,产L-丝氨酸量提高了12.3 %,达到7.46 g/L,转化时间缩短了58.3 %,效果显著。一定量的菌体在开放的转化体系中进行生物转化,连续转化了四次,产酸没有明显的变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 L-丝氨酸的理化性质
• 1.3 L-丝氨酸的应用
• 1.3.1 在医药方面的应用
• 1.3.2 在食品方面的应用
• 1.3.3 在化妆品方面的应用
• 1.3.4 在其它方面的应用
• 1.3.5 L-丝氨酸衍生物的应用
• 1.4 L-丝氨酸的生产方法
• 1.4.1 发酵法
• 1.4.2 生物酶法
• 1.5 分子生物学在L-丝氨酸生产中的应用
• 1.6 国内外L-丝氨酸的生产概况
• 1.7 研究意义
• 1.8 本课题的主要内容
• 第二章 产丝氨酸羟甲基转移酶菌株的分离筛选及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 方法
• 2.2.5 菌株的生理生化特性
• 2.2.6 菌株的分子生物学鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 苯甲醛标准曲线
• 2.3.2 菌株分离筛选结果
• 2.3.3 菌株ML206 的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 丝氨酸羟甲基转移酶产生菌的诱变育种
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 出发菌株
• 3.2.4 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养
• 3.3.2 菌体生长曲线的测定
• 3.3.3 诱变方法
• 3.3.4 突变株的筛选
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 菌体生长曲线的测定
• 3.4.2 甲醇耐受性突变株的选育
• 3.4.3 甘氨酸耐受性突变株的选育
• 3.4.4 磺胺胍抗性突变株的选育
• 3.4.5 L-丝氨酸产生菌的选育谱系
• 3.4.6 菌种ML216 遗传稳定性实验
• 3.5 本章小结
• 第四章 菌株M.aminovorans ML216培养基和发酵条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供实验菌株和培养基
• 4.2.2 菌体培养方法
• 4.2.3 生长条件对产酶的影响
• 4.2.4 试验设计
• 4.2.5 流加甲醇对发酵过程的影响
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 氮源及其添加量对ML216 菌株产酶的影响
• 4.3.2 碳源及其添加量对产酶的影响
• 4.3.3 培养基初始pH 对产酶的影响
• 4.3.4 发酵温度对产酶的影响
• 4.3.5 发酵时间对产酶的影响
• 4.3.6 Plackett-Burman 设计因素水平
• 4.3.7 影响M.aminovorans ML216 产SHMT 活力的关键因素的确定
• 4.3.8 应用响应面分析法确定重要因素的最佳水平
• 4.3.9 M.aminovorans ML216 的SHMT 产酶水平响应面交互作用分析与优化
• 4.3.10 流加甲醇对发酵的影响
• 4.4 结论
• 第五章 菌株M.aminovorans ML216转化条件的优化
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 试剂和仪器
• 5.2.2 L-丝氨酸检测方法
• 5.2.3 转化
• 5.2.4 转化条件的优化
• 5.2.5 在转化体系中添加PLP 对产酸率和转化时间的影响
• 5.2.6 SHMT 转化稳定性的研究
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 纸层析法测定转化体系中的L-丝氨酸
• 5.3.2 转化条件对SHMT 的影响
• 5.4 结论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 参考文献