论文摘要
SARS病毒只能感染人类、灵长类等少数动物,由于缺乏方便实用的实验动物模型,使得对它的研究受到很大制约。基于目前对SARS病毒的研究,人们发现了SARS病毒的受体是人的2型血管紧张素转换酶（hACE2）,有研究通过细胞转染,在各种细胞中表达SARS病毒的功能性受体hACE2后,SARS病毒在所有的细胞中都能得以复制,只不过由于hACE2表达水平的不同产生的病毒的滴度有所差异,研究发现某些细胞并不感染SARS病毒,但转染表达hACE2后细胞却能够支持病毒的感染和复制,并检测到病毒滴度,转基因动物技术的出现,提供了一种改变动物的遗传信息,使其获得新的表型的方法。利用转基因方法将人的病毒受体在小鼠体内表达,使只能感染人的病毒能感染小鼠,已经为人类研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的动物模型。本研究将上述细胞水平的研究进展和对SARS病毒受体的研究应用于制备表达SARS冠状病毒功能性受体hACE2的转基因小鼠,尝试建立表达有hACE2基因的SARS病毒易感的小鼠模型,为此开展了下面的研究。以质粒PCMV-SPORT6为模板,使用长距离PCR方法扩增获得hACE2全长cDNA序列,将其克隆进PCAGGS的真核表达载体,并且添加了PGK-neo筛选标记,通过脂质体的方法我们转染了小鼠的NIH3T3细胞,通过PCR和Southern的检测,我们得到了稳定整合有hACE2基因的阳性细胞株,通过Western免疫印迹、流式细胞术分析以及免疫荧光的方法我们检测到了hACE2在小鼠NIH3T3细胞中广泛表达,并且通过体外蛋白结合实验证明了小鼠NIH3T3细胞中表达的SARS病毒的受体蛋白hACE2能很好的同SARS病毒的S蛋白结合。我们利用克隆的hACE2全长cDNA序列构建了两个转基因载体PCAGGS-hACE2和pCDNA3.1+-hACE2用于转基因小鼠的制备。通过显微注射的方法获得了12只基因组中整合有hACE2的PCAGGS-hACE2转基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2转基因小鼠。PCR和Southern检测都证实12只PCAGGS-hACE2转基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2转基因小鼠的基因组中的确整合有转入基因,转基因阳性率分别为12.5%和9.1%,各个founder经过传代建立各相应的转基因小鼠系。我们对转基因小鼠系中外源性hACE2表达进行了鉴定,首先我们提取了转基因小鼠肺组织的总RNA,进行了RT-PCR的检测,结果表明PCAGGS-hACE2转基因小鼠的肺组织中有hACE2的转录,而pCDNA3.1+-hACE2转基因小鼠的肺组织中未检测到hACE2的转录,证明PCAGGS在肺组织的表达效果优于pCDNA3.1+表达载体。我们又分别提取了PCAGGS-hACE2转基因小鼠和野生型阴性对照小鼠的肺组织总蛋白,用hACE2的多克隆抗体做Western免疫印迹。我们在转基因小鼠肺组织中检测到有hACE2的表达,然后通过组织免疫荧光的方法,对肺组织表达的hACE2蛋白进行定位,发现它在肺实质和肺泡上皮细胞中广泛表达。我们对小鼠肺组织中表达的hACE2的功能进行了鉴定,我们用FITC标记的SARS病毒的S蛋白,通过体外蛋白结合的方法检测了SARS病毒的S蛋白与小鼠肺组织中表达的hACE2蛋白的结合能力,组织免疫荧光的结果显示,转基因阳性小鼠肺组织表达的hACE2蛋白能很好的同SARS病毒的S蛋白结合,而野生型阴性小鼠则不能很好的结合,至此我们获得了表达有SARS病毒功能性受体hACE2的转基因小鼠,该转基因小鼠可以作为SARS病毒易感的动物模型用于SARS相关的研究中。
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标签：冠状病毒论文; 人型血管紧张素转化酶论文; 转基因小鼠论文; 肺组织论文; 细胞论文;