HL-CMS不育候选基因orf216的克隆及稻瘟病抗性基因Pi36的功能研究

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是世界最重要的粮食作物之一。上个世纪,以植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）为基础的“三系”杂交稻的利用使水稻的产量发生了飞跃的变化。目前,一方面由于世界人口的不断增长和耕地面积的不断减少,另一方面以病原菌和害虫等生物胁迫引起水稻的减产,使得目前世界的粮食问题尤为突出。因此,通过对作物品种的遗传改良以提高单位面积产量,将是解决人类对粮食的需求不断增加这一矛盾的主要途径。本研究在已有的HL-CMS不育相关片段HL-sp1分离和克隆基础上,利用TAIL-PCR技术进一步扩增其侧翼序列,对HL-sp1进行了结构和功能预测分析,并进行了遗传转化。采用RNAi技术以及亚细胞定位技术对稻瘟病抗性基因Pi36的功能进行了初步研究。取得了以下研究结果:1. HL-sp1侧翼序列的分析及基因预测采用单引物PCR以及改良的TAIL-PCR技术,成功地获得了HL-sp1 5’端2009 bp及3’端2555 bp的序列,将HL-sp1延伸至6740 bp。通过BLSAT序列比对,发现HL-sp1缺失了线粒体基因atp6的1-1772 bp,而且5’端近1700 bp序列与籼稻9311的线粒体序列同源性非常小,而与玉米的T-CMS和C-CMS线粒体DNA序列有部分的同源性。利用2种基因预测软件RiceGAAS （http://ricegaas.dna.affrc.go.jp）和Softberry的FGENESH （http://www.softberry.com）对HL-sp1进行了基因预测及注释分析。结果表明该序列包含2个ORFs。第一个ORF全长171bp,由4个不连续的较短的外显子组成,编码一个功能未知的蛋白;另外一个ORF由651bp组成,是一个独立的外显子,编码216个氨基酸,暂命名这个候选基因为orf216,通过与9311线粒体序列比对发现,orf216是由2个相差较远的基因的部分编码区和一个未知片段所组成的嵌合基因。2. HL-CMS不育候选基因orf216的细胞质特异性及表达分析以不育候选基因orf216的序列设计了特异性引物对水稻3种不同CMS类型的不育系、保持系、恢复系及杂交种进行PCR分析,证明不育候选基因orf216只存在于具有红莲型不育胞质的品种中。进一步利用反转录PCR对不育候选基因orf216进行了表达模式分析,初步结果表明该基因为组成型表达。3. HL-CMS相关不育候选基因orf216的克隆与遗传转化利用已经克隆的BT型水稻育性恢复基因Rf1b的线粒体定位信号肽序列和双元载体转化体系pCAMBIA1305.1,成功地构建了重组植物表达载体。以与红莲型不育系粤泰A（YTA）同核异质的保持系粤泰B（YTB）作为受体,通过农杆菌介导的遗传转化体系进行了候选基因的遗传转化,获得了一定数量的转化植株。对T0代转化植株进行了选择标记潮霉素基因和目的基因的PCR分子检测。结果表明候选基因成功地插入受体品种的基因组中。4.稻瘟病抗性基因Pi36 RNAi干涉载体的构建与遗传转化利用植物干涉表达载体pCAMBIA1300RS成功地构建了Pi36的5’端、3’端和NBS保守结构域的3个植物RNA干涉表达载体,分别将这些重组载体转化至农杆菌菌株EHA105后,对水稻抗病品种Q61进行遗传转化。经过分子鉴定后,获得了一批阳性转化植株。荧光定量PCR分析表明,3个干涉载体的转化植株中目的基因Pi36的表达量均有不同程度的下降,其中以ORF 5’端的片段构建的载体干涉程度最强。5.稻瘟病抗性基因Pi36亚细胞定位载体的构建与遗传转化将Pi36 ORF 1-1827 bp的序列通过NcoI和BglII酶切位点插入植物表达载体pCAMBIA1302,在35S强启动子的控制下在洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明Pi36基因的产物定位于细胞核。同时重组载体利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化,选取转化苗根尖进行观察,结果与瞬时表达一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 植物细胞质雄性不育
• 1.1.1 植物细胞质雄性不育特征及其分类
• 1.1.2 叶绿体与植物细胞质雄性不育
• 1.1.3 线粒体与植物细胞质雄性不育
• 1.1.4 植物CMS 相关的线粒体基因的克隆策略
• 1.1.5 植物CMS 相关的线粒体基因的功能分析
• 1.1.5.1 植物CMS 相关的线粒体基因的转录
• 1.1.5.2 植物CMS 相关的线粒体蛋白及作用特点
• 1.2 稻瘟病抗性基因的研究
• 1.2.1 稻瘟病研究的重要意义
• 1.2.2 稻瘟病抗性基因的研究进展
• 1.3 本研究的内容、目的及意义
• 1.3.1 本研究的主要内容
• 1.3.2 本研究的目的和意义
• 第2章 HL-CMS 相关片段HL-SP1 的侧翼序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料、试剂与设备
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 部分PCR 引物
• 2.2.4 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 线粒体基因组DNA 的提取
• 2.3.2 HL-sp1 5’端单引物扩增及片段克隆
• 2.3.2.1 单引物HLSP1R6 扩增HL-sp1 5’端
• 2.3.2.2 PCR 产物的回收纯化
• 2.3.2.3 目的片段与载体的连接
• 2.3.2.4 连接产物转化大肠杆菌及鉴定
• 2.3.3 TAIL-PCR 扩增HL-sp1 的侧翼序列
• 2.3.3.1 PCR 扩增
• 2.3.3.2 TAIL-PCR 扩增产物的克隆与测序
• 2.3.4 基因预测
• 2.3.5 候选基因的细胞质特异性分析
• 2.3.5.1 植物DNA 的微量快速提取
• 2.3.5.2 PCR 分析
• 2.3.6 候选基因在转录水平上的表达分析
• 2.3.6.1 植物RNA 的提取
• 2.3.6.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.3.6.3 cDNA 的PCR 扩增
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 YTA 线粒体及线粒体DNA 的提取
• 2.4.2 单引物HLSP1R6 扩增HL-sp1 5’端
• 2.4.3 TAIL-PCR 扩增产物电泳结果分析
• 2.4.4 TAIL-PCR 产物克隆分析
• 2.4.5 测序结果分析
• 2.4.6 基因预测结果及分析
• 2.4.7 候选基因orf216 的细胞质特异性检测结果
• 2.4.8 候选基因orf216 RNA 水平的表达分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 单引物HLSP1R6 扩增HL-sp1 5’端侧翼序列
• 2.5.2 TAIL-PCR 扩增HL-sp1 的侧翼序列
• 2.5.3 基因的预测、表达以及细胞质特异性分析
• 第3章 HL-CMS 不育基因ORF216 植物表达载体的构建及遗传转化
• 3.1 引言
• 3.2 材料、试剂与设备
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 载体和菌株
• 3.2.3 主要试剂及植物组织培养用培养基
• 3.2.4 实验设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 水稻线粒体基因orf216 的克隆
• 3.3.1.1 水稻线粒体信号肽DNA 片段与pCAMBIA1305.1 的组装
• 3.3.1.2 带有线粒体信号肽的orf216 的超表达载体的构建
• 3.3.2 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的制备、转化与鉴定
• 3.3.3 农杆菌介导水稻的遗传转化
• 3.3.3.1 水稻愈伤组织的诱导及继代
• 3.3.3.2 农杆菌的活化及悬浮
• 3.3.3.3 愈伤组织的浸染及共培养
• 3.3.3.4 抗性愈伤组织的筛选、预分化及分化
• 3.3.3.5 幼苗的生根壮苗及移栽
• 3.3.4 转基因植株的分子检测以及GUS 染色
• 3.3.4.1 转化植株的PCR 检测
• 3.3.4.2 转基因植物的GUS 染色
• 3.3.5 转基因植株目的基因转录水平表达分析
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 水稻线粒体信号肽序列的克隆
• 3.4.2 HL-CMS 相关候选基因orf216 的表达载体的构建
• 3.4.3 植物遗传转化与转基因植株的获得
• 0 代转化植株的鉴定'>3.4.4 T₀代转化植株的鉴定
• 3.4.4.1 Hpt 基因的PCR 检测及GUS 染色
• 3.4.4.2 候选基因的PCR 检测
• 3.4.5 转基因植株中候选基因的表达分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 植物表达载体的构建
• 3.5.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 3.6 今后研究工作展望
• 第4章 稻瘟病新抗性基因P136 的干涉与亚细胞定位载体的构建及转化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 载体和菌株
• 4.2.3 主要试剂及植物组织培养用培养基
• 4.2.4 引物
• 4.2.5 主要设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 Pi36 干涉载体及亚细胞定位载体构建
• 4.3.1.1 载体构建策略
• 4.3.1.2 制备目的片段
• 4.3.1.3 双元载体DNA 的制备
• 4.3.1.4 目的片段的连接、转化与鉴定
• 4.3.2 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的制备、转化与鉴定
• 4.3.3 农杆菌介导水稻的遗传转化
• 4.3.4 农杆菌介导的烟草遗传转化以及细胞观察
• 4.3.4.1 外植体的制备
• 4.3.4.2 农杆菌的活化及悬浮
• 4.3.4.3 共培养
• 4.3.4.4 分化
• 4.3.4.5 生根
• 4.3.4.6 细胞观察
• 4.3.5 基因枪法转化洋葱表皮细胞及观察
• 4.3.6 转化植株的PCR 检测
• 4.3.7 转基因水稻Pi36 基因RNA 水平上的荧光定量PCR 分析
• 4.3.7.1 转化植株RNA 的提取
• 4.3.7.2 cDNA 的合成
• 4.3.7.3 荧光定量PCR 分析
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 Pi36 5’端干涉载体 pI1 的构建
• 4.4.2 Pi36 NBS 保守结构域干涉载体 pI2 的构建
• 4.4.3 Pi36 3’端干涉载体 pI3 的构建
• 4.4.4 Pi36 亚细胞定位载体p36YDW 的构建
• 4.4.5 水稻以及烟草遗传转化、转基因植株的获得
• 0 代转化植株的鉴定'>4.4.6 T₀代转化植株的鉴定
• 4.4.7 亚细胞定位观察
• 4.4.8 pI1、pI2 及pI3 转化植株中Pi36 基因表达量的分析
• 4.5 讨论
• 4.6 今后工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录一: 相关溶液及试剂配制方法
• 附录二 在读期间发表的论文、参与的科研课题及学术活动