论文摘要
目的:建立人成骨肉瘤耐甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）细胞系,对其生物学特性及其耐药机制进行初步探讨。方法:以MTX为诱导剂,采用药物冲击并逐步增加剂量方法,诱导人成骨肉瘤原代细胞系（Saos-2）,并建立耐甲氨喋呤细胞系（Saos-2/MTX4.4）;MTT法分别检测耐药细胞株对MTX、顺铂（Cisplatin,DDP）、阿霉素（doxorubicin,ADM）、异环磷酰胺（Ifosfamide,IFO）、表柔比星（Epirubicine,EPI）、比柔比星（Pirarubicin,THP）、紫杉醇（Paclitaxel,PTX）药物敏感性;计算其半数抑制浓度（IC50）和耐药指数,细胞抑制率=（1-耐药组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%,计算耐药指数= IC50（Saos-2/MTX4.4）/ IC50（Saos-2）;利用光学显微镜观察细胞一般形态的变化,透射电镜观察细胞系超微结构变化;不同培养时间点计数细胞数目变化,绘制细胞生长曲线,检测细胞增殖能力;利用流式细胞仪检测不同细胞系细胞周期比例变化,检测不同细胞系细胞周期分布;用RT-PCR方法检测不同细胞系还原性叶酸载体（reduced folate carrier , RFC）基因的mRNA的表达,半定量对比测定不同细胞系的RFC基因mRNA表达情况;用液闪液仪检测在含一定浓度3H-MTX培养液里不同时间进入Saos-2与Saos-2/MTX4.4细胞系内的药物浓度,检测不同细胞系的RFC基因的功能,初步探讨细胞产生耐药的机制。结果:经过27周的诱导,建立不同药物浓度冲击诱导的人骨肉瘤耐MTX细胞系（Saos-2/MTX1.1、Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4）,并对Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4细胞系与原代细胞系进行对比实验;光镜下观察Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4细胞系表现为细胞体积增大,胞浆更丰富,多角形及多核细胞数量较原代Saos-2细胞系明显增多;透射电镜显示Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4细胞株表面突起较原代Saos-2细胞株减少、且核仁增大;细胞生长曲线形态显示耐药细胞系生长曲线斜率较原代细胞减小,生长时间延长;流式细胞仪检测细胞周期发现,耐药细胞系G0和G1期明显增多, S期细胞所占比例减少;MTT法检测结果表明,Saos-2细胞系对MTX的IC50为25.78±0.29 ng/ml,Saos-2/MTX2.2对MTX的IC50为125.56±0.24 ng/ml; Saos-2/MTX4.4对MTX的IC50为328.24±0.29 ng/ml;其对MTX的耐药指数分别为原代细胞耐药指数的4.87和12.73倍;耐药细胞株对ADM、EPI、THP、TAXOL亦产生不同程度的交叉耐药,Saos-2与Saos-2/MTX4.4间上述药物的IC50存在显著差异（P<0.05）,而对DDP无明显耐药（P>0.05）;用RT-PCR方法检测发现耐药细胞系的RFC基因mRNA表达较原代细胞系Saos-2的RFC基因mRNA表达明显下降,耐药细胞系Saos-2/MTX2.2和Saos-2/MTX4.4的RFC基因mRNA是原代的24.45和31.70倍;用液闪液仪检测发现:在含3H-MTX培养液培养不同细胞系,进入细胞内药物的达峰时间均为30min,50min时细胞内的药物浓度达平台期,耐药细胞系平台期的细胞内药物浓度是原代细胞系平台期药物浓度的2.15倍。结论本实验建立了耐MTX人成骨肉细胞株Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTx4.4,耐药细胞系的建立为探索细胞耐药机制建立模型,并在基因水平探讨的耐药的机制。