论文摘要
目的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是严重影响人类健康的心血管疾病之一。动脉粥样硬化的发病机制复杂,已有的研究尚难以完全解释其发生的分子机制。Hsp70（heat shock protein70,Hsp70）不仅是细胞内重要的分子伴侣,而且在细胞外能够发挥细胞因子的功能,并与动脉粥样硬化的发生具有相关性。本研究系统认识了高脂诱导的大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆中Hsp70的变化规律;并进一步通过体外细胞学实验研究细胞外Hsp70对血管内皮细胞生物学功能的影响及其病理生理学途径,探讨血浆中Hsp70变化在动脉粥样硬化发生中的生物学意义,为寻求预防和治疗动脉粥样硬化的新措施提供思路。对象和方法选用健康雄性Wistar大鼠,体重180200g,随机分为对照组和高脂组。高脂组大鼠采用高脂饲料喂养,对照组常规饲料喂养;两组动物均自由饮水,持续喂养12周。每2周取血一次,检测血脂水平及血浆中Hsp70水平变化,同时对大鼠主动脉弓进行病理学检查,观察大鼠动脉粥样硬化的形成。体外实验采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,给予培养液不同浓度的Hsp70处理不同时间后,采用生物化学法检测培养液中LDH水平,采用MTT法检测血管内皮细胞存活率,观察细胞外Hsp70对血管内皮细胞的损伤作用;采用Western blot方法检测血管内皮细胞中TLR4和NF-κBp65蛋白的表达水平;采用ELISA方法检测培养液中黏附因子ICAM-1和细胞因子IL-6的水平,观察Hsp70对血管内皮细胞分泌细胞因子的影响。从大鼠外周血中分离淋巴细胞,给予培养液不同浓度的Hsp70处理不同时间后,采用ELISA方法检测细胞培养液中IL-6水平;给予血管内皮细胞不同浓度的IL-6处理不同时间后,采用ELISA方法检测培养液中ICAM-1水平,应用淋巴细胞黏附实验检测血管内皮细胞与淋巴细胞黏附情况,研究淋巴细胞在细胞外Hsp70诱导血管内皮细胞损伤中的介导作用。结果1大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆Hsp70水平的变化规律:高脂组大鼠高脂膳食2周后总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）水平较对照组显著升高（P <0.05）,且随着动脉粥样硬化的形成,高脂组大鼠血浆中TC和LDL水平呈现进一步升高的趋势。大鼠主动脉病理学检查显示,高脂膳食第6周时,高脂组大鼠血管壁内膜增厚,内膜下有脂质沉积形成的空泡,膜间隙增大;第10周时,胶原纤维增生,平滑肌细胞增生,细胞排列紊乱,动脉粥样硬化开始形成;第12周时,中膜层脂质浸润,纤维组织增生,形成片状或点状钙化的动脉粥样硬化斑块,动脉粥样硬化更加明显。对血浆Hsp70水平的检测结果显示,在第2周时,高脂组大鼠血浆Hsp70水平与对照组相比明显升高（0.18±0.021μg/ml vs 0.087±0.014μg/ml）,并且在第2周后呈现逐渐升高的趋势,到第12周时,高脂组大鼠血浆Hsp70水平达到了0.353±0.03μg/ml,与动脉粥样硬化的严重程度密切相关。免疫组化结果进一步显示,高脂膳食第6周时大鼠血管壁脂质沉积区域Hsp70含量较对照组明显增多,第10周时中膜层平滑肌细胞出现增殖,迁移和排列紊乱的病理改变的同时伴有Hsp70沉积明显增加,第12周时粥样斑块形成,在其损伤区域可观察到Hsp70的高度浓集。上述结果表明高脂组大鼠血浆Hsp70水平的升高不仅明显早于动脉粥样硬化的发生,且随着动脉粥样硬化的形成呈现逐渐升高的趋势。2 Hsp70对血管内皮细胞的损伤作用:不同浓度（0、1、5、10、100μg/ml）Hsp70处理血管内皮细胞不同时间（0、6、12、24、48h）后,内皮细胞存活率和培养液中LDH水平和对照组比较没有显著变化;ELISA结果未显示血管内皮细胞培养液中细胞因子ICAM-1和IL-6水平较对照组显著升高;Western blot结果未见细胞全蛋白中TLR4蛋白和核蛋白中NF-κBp65蛋白表达水平的明显变化。上述实验结果表明Hsp70未引起血管内皮细胞的损伤,亦未诱导本实验涉及的细胞因子的释放、TLR4蛋白表达变化和NF-κBp65蛋白核移位;提示细胞外HSP70可能不会直接作用于血管内皮细胞导致血管发生粥样硬化性损伤。3 Hsp70诱导淋巴细胞释放的IL-6对血管内皮细胞的影响:给予外周血淋巴细胞培养液不同浓度（0、1、5、10、100、200μg/ml）Hsp70作用24h,1μg/ml Hsp70既可引起淋巴细胞培养液中IL-6水平的显著升高（P <0.05）,随着Hsp70浓度增加,淋巴细胞分泌IL-6水平进一步升高;以10μg/ml Hsp70作用淋巴细胞8h后,细胞培养液中IL-6水平和对照组相比有显著升高,随着时间的延长,细胞培养液中IL-6水平呈现逐步升高的趋势。用不同浓度IL-6作用于血管内皮细胞,可以引起血管内皮细胞培养液中ICAM-1含量增加;并导致血管内皮细胞与淋巴细胞粘附率显著升高,具有明确的剂量、时间效应关系。提示Hsp70诱导淋巴细胞释放的IL-6导致血管内皮细胞的炎症反应,其可能是血浆Hsp70诱导血管发生粥样硬化性损伤的重要介导机制。结论1在高脂膳食诱导大鼠动脉粥样硬化形成过程中,血浆Hsp70水平的升高明显早于动脉粥样硬化的发生,并随着疾病病程的发展呈现逐步升高趋势。2细胞外Hsp70作用于血管内皮细胞后未见细胞的损伤效应及相关炎性细胞因子的分泌,未见对细胞中TLR4的表达和NF-κBp65细胞内分布产生明显影响,未显示细胞外Hsp70对血管内皮细胞直接损伤作用。3细胞外Hsp70诱导淋巴细胞释放IL-6,并继而引起血管内皮细胞的炎性反应和淋巴细胞黏附率的增高,提示血浆Hsp70可能通过淋巴细胞诱导血管内皮细胞的损伤,介导了动脉粥样硬化的形成。
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