论文摘要
锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus,KHV）引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种感染锦鲤疱疹病毒病（Kio herpesvirus disease, KHVD），造成间质性肾炎、鳃坏死等症状，且具有高度的致死性和感染性。1997年KHVD首次爆发流行于以色列的Magan Michae地区，造成当地大量锦鲤死亡，现已广泛分布于世界各地，且尚无有效疫苗对其进行预防和治疗。现已被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）列入水生动物疫病目录，我国农业部将其列为二类动物疫病。锦鲤疱疹病毒呈球形，正十二面体立体结构，成熟病毒具有包膜或囊膜，线性双股DNA结构，基因组中包含156个开放阅读框（ORF），鸟嘌呤和胞嘧啶含量达59.2%，目前对该病毒的了解和认识并不充分，仅有少部分结构和功能被了解，但其基因组学、免疫学、分子生物学方面的研究尚存在较多未知和争议。对锦鲤疱疹病毒病的疫苗研究刚刚起步，在灭活疫苗、减毒疫苗、基因疫苗等方面已经有一定进展，但尚未出现高效、安全且广泛认可的疫苗。本研究从锦鲤疱疹病毒基因组中扩增基因片段ORF30和片段ORF131，克隆插入PMD-18T载体中，鉴定正确后再次扩增基因ORF30和ORF131，克隆至载体pET-32a中，构建重组表达质粒pET-32a-ORF30和pET-32a-ORF131，转化大肠埃希菌（E.coil）BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达的重组融合蛋白经阴离子交换层析DEAE Sepharose4FF、阳离子交换层析SP Sepharose Fsat Flow、疏水层析Phenyl Sepharose6FF和金属螯合层析Chelating Sepharose Fsat Flow进行纯化。获得重组蛋白ORF30和ORF131，分析其基本理化性质，并用以免疫健康鲤鱼，确定其合理免疫程序，同时建立ELISA监测方法，监测免疫后鲤鱼体内抗体效价水平及抗体产生消长规律。经中国吉林株第2代锦鲤疱疹病毒进行攻毒保护性研究，对攻毒保护效果进行评价，以此探索开发一种能够有效抵抗锦鲤疱疹病毒的免疫疫苗。结果证明：重组质粒经PCR鉴定及测序证明构建正确；表达重组ORF30蛋白相对分子质量约29400Da，ORF131蛋白相对分子质量约55000Da，经SDS-PAGE分析，均以可溶性形式表达，表达量分别占菌体总蛋白的22.8%和24%。纯化后获得的重组蛋白ORF30和ORF131纯度均达到90%以上。蛋白ORF30和蛋白ORF131免疫后均能刺激鲤鱼产生高滴度抗体，1倍LD50剂量攻毒保护率均达到100%，3倍LD50剂量攻毒保护率达到60-80%，5倍LD50剂量攻毒保护率达到10-40%，且蛋白ORF131免疫效果优于蛋白ORF30免疫效果。综上所述，构建获得的高效融合表达蛋白ORF30和ORF131具有很强的免疫原性，刺激鲤鱼产生高滴度的中和抗体，对抵抗锦鲤疱疹病毒感染起到很好的治疗效果，为鲤鱼疱疹病毒（KHV）免疫制剂的研究奠定了基础。