华癸中慢生根瘤菌7653R共生固氮新基因MHK-RGS1的克隆与功能鉴定

论文摘要

本文基于前期构建的华癸中慢生根瘤菌7653R的Tn5-sacB转座子突变体库,通过盆栽筛选获得共生缺陷突变株HK311,其共生表型为结瘤不固氮（nod+fix-）。进一步通过TAIL-PCR克隆HK311突变株Tn5-sacB插入位点的侧翼序列,获得插入失活基因的全长序列（251 bp）,并命名为mhk-RGS1。利用本室已完成的7653R基因组精细图序列进行比较分析,发现该基因在7653R基因组上具有两个拷贝,称之为D22和D29编码区。Blastn分析表明：mhk-RGS11与豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv. viciae3841）基因pRL10094高度同源（93%）,其编码功能未知；与百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobium loti MAFF303099）的mll6353同源（85%）,其编码转座酶。为研究RGS1存共生固氮中的功能,本文分别构建了D22和D29编码区的置换载体,通过抗性筛选获得稳定插入失活突变株MhK-D22mutKm和MhK-D29mutKm。盆栽实验结果表明,插入失活突变体均与紫云英共生时形成白色无效根瘤,固氮酶活性显著下降。根瘤切片电镜观察表明,两个突变株的类菌体体积比野生型小,形态异常；根瘤组织石蜡切片观察结果表明突变体根瘤固氮区基本不含类菌体,呈现提前衰老趋势。Real-Time PCR检测亦显示mhk-RGS1是根瘤菌共生固氮过程中的特异表达基因。以上实验结果表明mhk-RGS1是根瘤菌共生固氮功能相关的必需基因。为了解RGS1的调控机制,本文通过生物信息学预测和RT-PCR实验,证明了mhk-RGS1的转录方向与其下游结构基因的表达方向一致。在D29编码区,mhk-RGS1基因与fixA、fixB、fixC结构基因紧密排列,形成一个基因簇。RT-PCR确定这个基因簇处于同一个操纵单元,是共转录的,因而合理解释了mhk-RGS1的插入失活导致类菌体固氮能力下降,又非完全丧失固氮能力,提示该基因与共生固氮表达调控相关。最后,在综合分析D22和D29编码区的启动子、终止子和Rfam等基础上,发现mhk-RGS1具有sRNA（small RNA）的片段小、位于基因间隔区的基本特征,但与已报道的sRNA无同源性。因此mhk-RGS1的调控功能模式还待进一步的实验研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 固氮基因
• 1.1.1 nif基因
• 1.1.2 fix基因
• 1.2 固氮基因调控机制
• 1.2.1 nifA调控
• 1.2.1.1 NifA蛋白结构
• 1.2.1.2 nifA基因表达调控
• 1.2.2 FixL-FixJ调控系统
• 1.2.3 FixK调控
• 54)调控'>1.2.4 RpoN(σ⁵⁴)调控
• 1.2.5 NtrBC和NtrYX调控系统
• 1.3 sRNA及其调控模式
• 1.3.1 ncRNA概述
• 1.3.1.1 ncRNA的分类与功能
• 1.3.2 sRNA
• 1.3.3 sRNA功能
• 1.3.4 sRNA调控模式
• 1.3.4.1 DsrA、RprA的上调模式
• 1.3.4.2 RyhB的下调模式
• 1.3.5 sRNA研究技术
• 1.4 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 抗生素
• 2.1.3 缓冲液与试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学基本操作
• 2.2.2 TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlace PCR,热不对称交错PCR）
• 2.2.3 SOE-PCR
• 2.2.4 本研究所用引物
• 2.2.5 双交换突变株筛选
• 2.2.6 植物盆栽
• 2.2.7 固氮酶活测定
• 2.2.9 根瘤菌类菌体总RNA提取
• 2.2.10 荧光定量PCR
• 2.2.11 DNA和sRNA序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 共生固氮基因mhk-RGS1的发现
• 3.2 RGS1的克隆与序列分析
• 3.2.1 TAIL-PCR克隆RGS1
• 3.2.2 RGS1的序列分析
• 3.3 7653R菌株RGS1基因插入失活突变体的构建及筛选
• 3.3.1 PCR扩增L端、R端、Km序列
• 3.3.2 SOE-PCR反应获得插入突变目的片段
• 3.3.3 置换载体的构建
• 3.3.4 突变体菌株的筛选
• 3.4 突变体菌株的共生表型
• 3.5 突变体形成根瘤的电镜观察和石蜡切片
• 3.6 RGS1下游基因的表达验证
• 3.7 RGS1在紫云英根瘤中的表达量检测
• 3.8 RGS1启动子预测及分析
• 3.9 RGS1转录操纵单元分析
• 4 讨论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢