论文摘要
蛋白质组学研究已经成为生命科学研究领域的前沿课题。它的主要研究内容包括分离和分析细胞及组织中的全部蛋白质,探索其表达与细胞功能的关系,发现具有诊断价值的疾病标志物和可作为药物靶标的功能蛋白质。蛋白质的N-末端包含许多有价值的信息。首先,蛋白质的三维结构特征对其生物学功能有着巨大的影响,而蛋白质的空间构象直接取决于其一级结构。因此,一级结构即氨基酸序列的测定已经成为研究蛋白质性质和功能的重要途径,而N-末端肽的鉴定更是其中的关键组成部分。所有蛋白质的合成都起始于N端（通常为Met或N-甲酰化的Met）,所以这个区域提供了蛋白质加工最初的、并且重要的位点,对其生物学功能有着巨大的影响。例如蛋白质的半衰期与N端氨基酸的特异性有关,即N端氨基酸残基对蛋白质的寿命有控制作用（N-end rule）。而N端乙酰化、豆蔻酰化等修饰造成蛋白质N-末端的封闭,这些修饰都可能与蛋白质的稳定性、功能和降解相关。另外,蛋白质的末端序列特异性很高,通过末端少数的几个氨基酸残基就可以实现对大多数蛋白质的可靠鉴定。根据对SWISS-PROT数据库的统计,N-末端5个氨基酸残基长度的序列对蛋白质鉴定的特异性,依据物种不同,平均达到了7897%。生物质谱已经成为蛋白质组学研究中蛋白质鉴定和定量的关键技术,基于质谱技术的肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting, PMF）和串联质谱（MS/MS）方法（包括肽序列标签（peptide sequence tag, PST）和从头测序（de novo sequencing）技术）结合生物信息学的数据检索和分析工具,已经建立了蛋白质组研究中规模化蛋白质鉴定的通用策略。由于末端序列的高特异性和高信息量,基于N-端和C-端氨基酸序列分析的蛋白质组学（terminal proteomics）将会对蛋白质的鉴定和功能分析提供更有价值的信息。随着翻译后修饰蛋白质组研究的深入开展,也有必要对蛋白质N端修饰进行系统研究。但是由于蛋白质肽段混合物高度的复杂性,且N-末端发生修饰的多样性和不均一性,都使目前蛋白质N端肽的针对性研究较少,还没有一种简便可靠的方法可以规模化地将末端肽从蛋白质肽段混合物中选择性地分离并鉴定出来,基于N端肽的蛋白质组定量方法也鲜有报道。基于此,本研究采用纳米级Fe3O4为载体,首次制备了表面键合异硫氰酸苯酯官能团的磁性纳米材料,建立了基于新型纳米材料的操作简便、快捷的封闭N端肽分离鉴定新方法,并用于人肝癌细胞系HepG2的蛋白质N-末端肽的分离鉴定中,获得了满意的结果。在此基础上,又发展了一种N端肽酸酐同系物标记结合质谱技术的蛋白质组相对定量新方法,该方法有效避免了大部分常用同位素试剂因质量差别小,易产生同位素峰重叠,造成定量不准确的问题;论文最后探索了磺酸化修饰结合离子交换色谱-质谱技术的方法在大肠杆菌N-末端肽富集鉴定中的应用。研究分为以下几部分:第一章,主要综述了目前蛋白质组学分离鉴定研究中的关键技术——电泳、色谱等高效的分离技术、软电离的质谱技术、生物信息学及其它新技术的发展和应用;特别是具有重要生物学意义的蛋白质N端序列的研究方法进展,并依此提出了本课题的研究方向。第二章,针对目前蛋白质组学中对蛋白质N-末端的研究方法较少、操作繁琐及缺乏针对性分离鉴定方法的问题,首次合成了一种新型异硫氰酸苯酯（DITC）键合的磁性纳米粒子（MNPs）,并将其用于蛋白质封闭N-末端肽的分离鉴定中。首先通过化学共沉淀法合成了四氧化三铁的磁性核心,并在核心外包裹硅氧烷,然后通过中间交联体将苯异硫氰酸酯官能团连接到材料表面,最终得到异硫氰酸苯酯键合的磁性纳米材料,并进行了材料的电镜及红外表征。蛋白质经过变性、还原、烷基化、酶切处理后,用氧-甲基异脲封闭肽段侧链的ε-氨基;然后与DITC-MNPs混合反应。在偏碱性的环境中,含有自由氨基的肽段共价结合到磁性材料上,通过外加磁场的作用,封闭的N端肽段留在溶液中被分开进而进行质谱鉴定。与现有的方法相比,DITC-MNPs与肽段的氨基是共价作用,比一些亲和方法的作用力更强,因此可以对封闭的N端肽有更特异的分离;而与使用微米级的功能材料相比,纳米级磁性材料极大的比表面积使其具有更大的负载量;并且DITC-MNPs材料制备方便、消耗少、分离操作简便快捷。此方法为不能进行Edman测序的N端封闭蛋白质的N端测序提供了操作方便、快速的鉴定方法;并将其用于复杂体系——人肝癌HepG2细胞系的蛋白质封闭N-末端肽的分离鉴定中。第三章,针对使用稳定同位素标记进行蛋白质相对定量研究时同位素峰易重叠影响定量结果的准确性,以及同位素试剂价格昂贵的问题,进行了N-末端酸酐同系物标记结合质谱技术在蛋白质相对定量中的初步研究。通过酸酐同系物标记蛋白质的N-末端,经过凝胶电泳分离,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行鉴定,建立了一种基于化学标记和质谱技术相结合的蛋白质N-末端鉴定和相对定量新方法。标记后的N-末端肽以相差14 Da的成对峰形式在质谱中出现,而非N-末端肽则是单峰呈现,从而实现了末端肽的特异性识别;通过对三种蛋白质进行同系物标记,然后按不同比例混合的溶液进行相对定量,其定量误差分别为16.16%、4.75%和-24.18%。与同位素试剂类似,同系物化合物有着相似的物理化学性质而质量数不同,因此可以用于分别标记样品和定量;此外,酸酐同系物试剂比同位素试剂价格便宜,降低了实验消耗;同时14 Da的质量差避免了大部分同位素试剂之间较小质量差所带来的质谱图上同位素簇峰的重叠,还不易与其它常见的质量差（如18 Da的脱水、17 Da的脱氨及16 Da的甲硫氨酸氧化）混淆;最后,酰化标记反应可以在常用的蛋白质溶解缓冲液中高效进行,并允许尿素、SDS等变性剂或去污剂的存在。此方法适用于所有N-末端未封闭的蛋白质的相对定量分析。第四章,由于蛋白质的N-末端是可以修饰的,而发生在生物体内的蛋白质N端修饰状态是不清楚的,即使是注释信息最可靠的蛋白质数据库SWISS-PROT,有关蛋白质N-末端的信息也很贫乏,因此这对所有基于数据库检索的蛋白质N-端分析方法造成困难。磺酸化修饰后的肽段在MS/MS中会有连续的y系列离子出现,有利于进行肽段的de novo测序。因此,本章探索了磺酸化修饰结合离子交换色谱分离和质谱鉴定的方法在大肠杆菌N-末端肽富集鉴定中的应用。鉴定到的末端序列特征与已知信息有很好的一致性,研究发现与氨基端Met残基毗邻的氨基酸残基为Ala、Gly等时,蛋白质更容易发生Met剪切;并找到了一条去除23个氨基酸残基的信号肽的端肽。总之,本论文发展了功能化磁性材料并建立了结合化学方法的三种有效的分离分析方法,为蛋白质的N-末端肽的分离富集和鉴定提供了简捷、通量化的研究手段,无论是对其一级结构的分析还是对蛋白质的末端加工、修饰研究,都具有参考价值和意义。