论文摘要
急性冠脉综合症（acute coronary syndromes, ACS）是冠状动脉粥样硬化性心脏病患者死亡的主要原因,而ACS的主要发生机制是冠状动脉壁不稳定粥样硬化斑块的破裂及继发的血栓形成,因此人们已将注意力由管腔的狭窄程度转向冠脉内斑块的稳定性,目前研究认为炎症反应在斑块破裂中起重要作用,但促发斑块破裂的使动因素和关键环节尚未明确,如何预测斑块的稳定性并做到防患于未然是近年来的研究热点之一。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）是锌依赖性蛋白酶家族,其中MMP-9,主要降解IV、V、VII、X型胶原、眀胶、纤维连接蛋白等,通过降解斑块纤维帽在ACS的发病机制中起着决定性作用。组织金属蛋白酶抑制物-1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）是内源性MMP-9的特异性抑制因子,可阻断MMP-9与底物结合,限制胶原的降解,因此二者的动态平衡是决定斑块稳定性的重要因素,但目前对ACS患者有关TIMP-1的研究结论不一致,未能将MMP-9与TIMP-1二者有机地结合在一起进行研究。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）是动脉粥样硬化形成及发展过程中的重要致病因子,可刺激特异性受体血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）表达上调,而LOX-1作为ox-LDL的细胞表面受体,介导了ox-LDL的许多生物作用,如LOX-1活化后可诱导细胞凋亡、上调MMPs表达,而MMPs表达增加及细胞凋亡均可引起斑块纤维帽变薄,导致斑块不稳定、易于破裂,并最终导致ACS发生。然而,LOX-1在ACS中的具体机制还有待进一步研究。临床研究显示钙通道阻滞剂具有独立于降压外的血管保护作用,可以减缓动脉粥样硬化进展并降低心血管事件发生率,如PREVENT研究中氨氯地平虽不能减缓冠脉狭窄的进展,但可明显减慢颈动脉粥样硬化的进展及降低住院期间的不稳定心绞痛及血管再重建发生率。但氨氯地平能否稳定斑块及其可能的机制尚未阐明。本课题分四部分,首先观察ACS患者外周血MMP-9、TIMP-1、hs-CRP炎症因子的水平变化,进一步阐明MMP-9、TIMP-1、hs-CRP与斑块不稳定性的关系,之后观察ACS患者外周血sLOX-1与ox-LDL的水平变化,探讨sLOX-1与ox-LDL及其他血脂成分的相关性、与冠脉病变程度的相关性、与MMP-9、TIMP-1、Hs-CRP的相关性,以阐明LOX-1与冠脉粥样斑块不稳定性的关系;第三部分分离冠心病患者的外周单核细胞与ox-LDL共同孵育,并给予多聚肌苷酸（PIA, LOX-1受体阻断剂）及PDTC（NF-KB抑制剂）干预,以阐明LOX-1对MMP-9、TIMP-1的调节及其机制;最后在细胞培养基础上观察氨氯地平对单核细胞LOX-1及MMP-9、TIMP-1表达的影响,探讨氨氯地平能否稳定斑块及其可能的机制。第一部分:基质金属蛋白酶-9及其抑制物与冠状动脉粥样硬化斑块不稳定性的关系目的:本研究通过观察ACS患者外周血MMP-9、TIMP-1、hs-CRP的水平变化,探讨它们之间的相互关系以及与冠脉病变程度的关系,进一步阐明它们与斑块不稳定性的关系。方法:入选经冠状动脉造影检查的住院患者60例,分为ACS组（n=20,其中急性心肌梗死11例、不稳定型心绞痛9例）,稳定型心绞痛（stable angina pectoris, SAP）组（n=20）,对照（controls, C）组（n=20）。ACS患者入院后即刻、SAP患者及对照组入院后次日晨空腹抽取静脉血2ml,自然凝固后1h内离心取血清置于-700C冻存备用,应用ELISA法测定MMP-9、TIMP-1浓度,应用乳胶颗粒增强速率散射比浊法测定Hs-CRP浓度。结果:1 ACS组与SAP组的基本临床情况包括性别、血压、血糖、血脂及病变支数、狭窄积分等方面没有统计学差异（均P>0.05）,SAP组患者年龄较ACS组（P<0.05）及对照组（P<0.01）患者年龄高,而ACS患者较SAP组及对照组吸烟者多（P<0.05）,近1个月内服药情况除他汀类药物两组冠心病患者之间无差异（均P>0.05）,而对照组与两组冠心病患者有差异（均P<0.05）。2各组间hs-CRP、MMP-9、TIMP-1水平的比较:ACS患者血清hs-CRP、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平均高于SAP组（均P<0.05）及对照组（均P<0.05）;SAP患者外周血清MMP-9高于对照组（P<0.05）。3 ACS患者治疗前后MMP-9、TIMP-1、hs-CRP水平的比较:ACS患者治疗后hs-CRP、MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平均较治疗前降低（均P<0.05）。4各炎症因子之间及与病变程度的相关性:MMP-9与TIMP-1呈正相关（r=0.491, p<0.01）、与hs-CRP呈正相关（r=0.507, p<0.01）;hs-CRP与TIMP-1无显著相关;各炎症因子与代表病变程度的冠脉病变支数及冠脉狭窄积分之间无显著相关。第二部分:急性冠脉综合征患者外周血sLOX-1的水平与MMP-9的相关性及斑块不稳定性的关系目的:观察冠心病患者外周血sLOX-1、ox-LDL的水平变化,进一步探讨sLOX-1与ox-LDL及其他血脂成分的相关性、与冠脉病变程度的相关性、与MMP-9、TIMP-1、Hs-CRP的相关性,以阐明LOX-1与冠脉粥样斑块不稳定性的关系。方法:研究对象为第一部分的,应用ELISA法测定MMP-9、TIMP-1浓度,应用乳胶颗粒增强速率散射比浊法测定Hs-CRP浓度。结果:1各组间ox-LDL（ug/dl）、LOX-1（ng/ml）水平的比较:ACS患者血清ox-LDL、LOX-1水平均高于SAP组（均P<0.05）及对照组（均P<0.05）;SAP患者外周血清ox-LDL、LOX-1高于对照组（均P<0.05）。2急性冠脉综合征患者治疗前后ox-LDL、LOX-1及各血脂（mmol/l）水平的变化:治疗后血清TC、LDL、LOX-1、ox-LDL水平均低于治疗前（均P<0.05）;TG、HDL水平无显著变化（均P>0.05）。3血清LOX-1与炎症因子、病变程度、ox-LDL及其他血脂成分的相关性分析:以所有冠心病患者作为整体LOX-1与ox-LDL及其它血脂成分均无显著相关,但在ACS组LOX-1与ox-LDL（r=0.557, p<0.01）正相关,与其它血脂成分无显著相关;LOX-1与MMP-9（r=0.568, p<0.01）、MMP-9/TIMP-1（r=0.513, p<0.01）正相关,与TIMP-1、hs-CRP及病变支数、冠脉狭窄积分无显著相关。第三部分:LOX-1对MMP-9、TIMP-1表达调控机制的研究目的:观察CHD患者外周血单核细胞经不同干预后LOX-1及MMP-9、TIMP-1表达的变化,探讨LOX-1对MMP-9、TIMP-1表达的调控及其调控机制。方法:分离收集冠心病患者的外周血单核细胞,分如下4组,空白对照组:单核细胞在不含血清的RPMI-1640培养基中孵育24小时;ox-LDL组:在不含血清的RPMI-1640培养基中加ox-LDL（40ug/ml）孵育24小时;多聚肌苷酸（PIA、LOX-1抑制剂）组:在不含血清的RPMI-1640培养基中先加PIA250ug/ml孵育1小时、之后加ox-LDL（40ug/ml）继续孵育24小时;PDTC（NF-KB抑制剂）组:在不含血清的RPMI-1640培养基中先加PDTC 10-5mol/l培育1小时之后加ox-LDL（40ug/ml）继续孵育24小时;之后收集细胞上清液离心后冻存于-700C备用,收集单核细胞用于提取总RNA并用RT-PCR方法测定LOX-1及MMP-9、TIMP-1mRNA的表达。结果:1冠心病患者外周血单核细胞经ox-LDL刺激24小时后,LOX-1、MMP-9表达增加,而用PIA预刺激后再加ox-LDL则单核细胞LOX-1、MMP-9表达与ox-LDL组相比显著减少,与对照组比较无差异;而用PDTC预刺后再加ox-LDL则单核细胞LOX-1、MMP-9的表达与ox-LDL组相比也显著减少,但LOX-1与对照组相比表达仍增多。2冠心病患者外周血单核细胞经ox-LDL刺激24小时后,TIMP-1表达无显著性变化,经PIA及PDTC预刺激后TIMP-1表达也无显著性变化。第四部分:氨氯地平对单核细胞LOX-1及MMP-9、TIMP-1表达的影响及其机制的研究目的:观察氨氯地平对单核细胞LOX-1及MMP-9、TIMP-1表达的影响,探讨氨氯地平能否稳定斑块及其可能的机制。方法:分离收集冠心病患者的外周血单核细胞,分如下3组,空白对照组:单核细胞在不含血清的RPMI-1640培养基中孵育24小时;ox-LDL组:在不含血清的RPMI-1640培养基中加ox-LDL（40ug/ml）孵育24小时;氨氯地平+ox-LDL组:在不含血清的RPMI-1640培养基中先加氨氯地平（10-6mol/l）培育1小时,之加ox-LDL（40ug/ml）继续孵育24小时;之后收集细胞上清液离心后冻存于-700C备用,收集单核细胞用于提取总RNA并用RT-PCR方法测定LOX-1及MMP-9、TIMP-1mRNA的表达。结果:1氨氯地平预刺激后,单核细胞LOX-1mRNA的表达与ox-LDL组相比明显减少（均p<0.01）、与对照组比较无统计学差异,而单核细胞MMP-9mRNA的表达与ox-LDL组及对照组相比均明显减少（均p<0.01）,TIMP-1mRNA的表达与ox-LDL组和对照组相比无差异（均p>0.05）。2在氨氯地平预刺激组,细胞上清液中sLOX-1蛋白水平与ox-LDL组相比明显减少（均p<0.01）、与对照组比较无统计学差异,而MMP-9蛋白水平与ox-LDL组及对照组相比均明显减少（均p<0.01）,TIMP-1蛋白水平在各组间无差异（均p>0.05）。综上得出如下结论:1 ACS患者外周血MMP-9升高、MMP-9/TIMP-1比值增加与ACS斑块不稳定性有关。2 ACS患者外周血sLOX-1升高与MMP-9、MMP-9/TIMP-1呈正相关,提示LOX-1通过MMP-9、MMP-9/TIMP-1参与了ACS不稳定斑块的形成。3 ACS患者外周血sLOX-1、Ox-LDL、hs-CRP、MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平升高均可反应斑块的不稳定性。4 ACS患者LOX-1介导单核细胞MMP-9mRNA表达增加,提示LOX-1通过调控MMP-9的表达影响斑块的稳定性。5氨氯地平通过抑制单核细胞LOX-1---MMP-9表达通路影响斑块的稳定性。
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