微囊藻毒素对鱼类和哺乳动物致毒效应的比较研究

论文摘要

世界各地的蓝藻水华频繁暴发,已经成为全球范围的生态灾难,微囊藻毒素（microcystin,MC）导致的一系列生态环境和人类健康问题也引起了广泛的关注。大量研究表明哺乳动物比鱼类对MC更加敏感,学者们就MC对此两类动物致毒效应差异的原因进行了一些推测:1)鱼类出现肝脏功能衰竭,不同于哺乳类动物的低血量休克以及由此引发的循环系统障碍;2)血液在鱼类肝脏的灌注速率低,仅为哺乳动物的1/4,使得MC转运慢;3)鱼类循环系统不发达,血压低（约为哺乳动物的1/4）,对MC更具耐受性。然而,支持上述推测观点的实验性研究工作开展的却并不多。因此,本研究选择鲫和家兔为研究对象,开展腹腔注射MC染毒试验,探讨MC对鱼类和哺乳动物不同的致毒机制。主要从肝脏损伤、血液循环系统障碍两个方面开展研究。为了更加深入研究微囊藻毒素对血液循环系统损伤,还设计了微囊藻毒素对家兔造血机能影响的试验。主要研究结果如下:1.染毒及解剖特征腹腔注射MC对鲫染毒48h的LD50为250μg MC-LR/kgBW,而家兔的LD50为33μg MC-LRe/kgBW。对鲫以200,50μg MC-LR/kgBW剂量染毒,对家兔以50,12.5μgMC-LR/kgBW剂量染毒。于注射后1,3,12,24,48h取样。高剂量组鲫从12h开始出现大量腹水,且腹水中具有血液成分,RBC达（5.46±1.51）×104cells/μL,腹水中红细胞肿胀变形、细胞膜破裂、细胞核游离。而家兔并未出现腹水现象。2.肝脏损伤检测动物血清中肝脏损伤有关的酶学指标,包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）,染毒后两类动物血清酶活性变化迅速,显著增加。两类动物抗氧化系统抵御活性氧（ROS）的响应机制不同。鲫在被MC染毒后,相关抗氧化酶（如SOD、CAT、GPx和GR等）活性在试验前半段（1-3h）出现升高的变化,而后半段（12-48h）时间里呈现持续下降。高剂量组鲫GPx活性在染毒1h即显著增加,比对照组水平增加了15.64±4.15%,而SOD、CAT酶活性在染毒后3h达峰值,比对照组分别增加了33.46±8.97%和68.38±12.47%。LPO水平在试验前半段时间里与对照组无显著变化,试验后期出现显著的升高。家兔抗氧化酶从试验一开始便持续走低,高剂量组家兔染毒后1h时肝脏SOD、CAT、GPx和GR等酶的活性比对照组分别下降了40.47±8.15%、35.33±6.75%、41.67±10.23%和76.58±13.46%。LPO水平从1h即开始大幅上升直至试验结束。3.血液循环系统障碍两个剂量组鲫和低剂量组家兔随着肝脏毛细血管通透性增强而出现循环血量的显著下降,组织器官血管渗漏及由此产生的血量下降是导致动物贫血的重要原因之一。染毒鲫肝脏组织内毛细血管通透性显著增强,高剂量组鲫在染毒后1h时即显著增加118.18±12.39%。染毒鲫循环血量显著降低,高剂量组鲫染毒48h时比对照组水平下降了55.45±4.50%。染毒家兔出现肝脏组织内毛细血管通透性显著增加的现象,高剂量组家兔3h时较对照组增加了152.63±8.53%。高剂量组家兔在MC染毒后,循环血量并无显著变化,而低剂量组家兔循环血量则在3-48h的时间里逐渐降低,直至48h的最低值,降幅达19.20±2.21%。染毒动物出现血压下降,但是鲫出现心率代偿性升高调节,而家兔则不能。染毒鲫平均动脉压（MAP）、平均舒张压（MDP）以及平均收缩压（MAP）等指标在整个试验过程中均显著降低,高剂量组鲫1h的MAP值比对照组水平下降了60.99±4.38%;血压下降具有剂量和时间效应关系。染毒鲫出现心率（HR）显著升高,高剂量组鲫在染毒后1h即开始出现心率的显著上升至最高值,比对照组增加了120.78±11.25%,而后的3-24h时间里,虽然心率仍显著高于对照组水平,但呈逐渐降低的变化趋势,直至48h时的最低值,与对照组无显著性差别。染毒家兔也出现血压下降的变化。高剂量组家兔在2h 30 min时的MAP仅为初始血压值的30.02±5.78%,家兔的生命体征微弱,濒临死亡。低剂量组家兔心率与对照组并无显著性差异,高剂量组家兔心率在3h时极显著地低于对照组心率（下降36.68±6.73%）。4.贫血与造血器官损伤染毒动物在试验后半段时间（24-48h）均呈现贫血症状,主要造血器官发生病理性损伤。鲫呈现RBC、Hb、Ht等指标的显著下降,高剂量组的上述三个指标在48h时比对照组分别降低了58.48±8.78%、55.79±7.54%和56.86±8.32%,呈现出明显的贫血现象;而MCV、MCH、MCHC等红细胞参数并无显著变化,表明鲫的贫血为正常红血球的贫血（normocytic anemia）,Hb的显著降低说明并未出现溶血。鲫的主要造血器官肾脏、肝脏均发生显著的病理变化。低剂量染毒组家兔也具有RBC、Hb、Ht等血象指标的显著下降,48h时的上述指标仅为对照组的62.71±8.31%、81.03±11.76%、72.22±9.46%,也具有显著贫血症状（normocyticanemia）。对主要的造血器官-骨髓进行超显微观察,透射电镜观察结果表明骨髓细胞具有显著的病理变化,染色质异常凝集,呈月牙形或半圆形变化、内质网扩张、线粒体肿胀等。5.微囊藻毒素对哺乳动物造血机能的影响本研究还开展了MC对家兔造血机能影响的探索性试验,因为迄今尚未见MC对动物造血机能影响的研究。连续注射MC至14d时血象指标如RBC、Hb、Ht等显著降低说明家兔出现贫血现象。造血生长因子显著下降,14d时EPO、IL-3、IL-6的三种正性造血生长因子水平仅为对照组的57.59±5.50%、51.63±6.38%和68.59±7.91%,表明造血生长因子的调控能力受到抑制。MTT法测定骨髓细胞增殖能力随着染毒时间延长而逐渐下降,14d时家兔骨髓细胞增殖能力极显著低于对照组水平,仅为对照组水平的69.23±8.56%,表明骨髓细胞增殖、分化能力受到损伤。骨髓嗜多染红细胞微核率显著升高,14d时的微核率为对照组的3.9倍。透射电镜对骨髓的病理观察表明,骨髓细胞具有典型的凋亡形态特征,细胞核形状不规则,染色质呈月牙形或半圆形,并且异常凝集,内质网扩张,线粒体肿胀。上述研究结果表明MC染毒能够导致哺乳动物主要造血器官-骨髓的损伤,导致动物造血机能的减退。

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摘要

Abstract

缩略语表

第一章文献综述

第一节水体富营养化和蓝藻水华

1 水体富营养化

2 蓝藻水华

2.1 蓝藻水华的形成

2.2 蓝藻水华的危害

3 蓝藻毒素

3.1 肝毒素

3.2 神经毒素

3.3 其它毒素

第二节微囊藻毒素的一般概况

1 微囊藻毒素的产生

2 微囊藻毒素的理化性质

3 微囊藻毒素的检测

4 微囊藻毒素的降解

5 微囊藻毒素的致毒机制

第三节微囊藻毒素对鱼类的致毒效应研究

1 微囊藻毒素在鱼体内的分布和累积

2 微囊藻毒素对鱼类的生态毒理学效应

3 微囊藻毒素对鱼类致毒的病理观察

4 微囊藻毒素对鱼类的氧化损伤

5 微囊藻毒素对鱼类致毒的生化效应

第四节微囊藻毒素对哺乳动物的致毒效应

1 微囊藻毒素对哺乳动物的肝毒性研究

2 微囊藻毒素对哺乳动物的其它毒性研究

3 关于微囊藻毒素的流行病学研究

第五节课题立题背景及研究目的

第二章微囊藻毒素对鲫的急性毒性研究

第一节微囊藻毒素对鲫致毒的行为观察

1 引言

2 材料与方法

2.1 微囊藻毒素制备与检测

2.2 试验鱼

50的测定'>2.3 LD₅₀的测定

2.4 染毒与采样

2.5 死亡率及行为观察

2.6 血细胞形态学观察

2.7 腹水标本制备和细胞病理检测

2.8 统计分析

3 结果

50和死亡率'>3.1 LD₅₀和死亡率

3.2 呼吸频率变化

3.3 异常游动行为

3.4 解剖特征

3.5 腹水细胞病理观察

4 讨论

第二节微囊藻毒素对鲫肝脏的损伤

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验鱼

2.2 染毒

2.3 血样采集

2.4 肝组织匀浆的制备

2.5 肝脏显微结构样品制备与观察

2.6 血液生化指标的测定

2.7 肝组织抗氧化系统指标的测定

2.7.1 总超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

2.7.2 过氧化氢酶（CAT）活性的测定

2.7.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的测定

2.7.4 谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定

2.7.5 脂质过氧化（LPO）的测定

2.7.6 肝组织匀浆蛋白含量测定

2.8 统计分析

3 结果

3.1 肝脏系数变化

3.2 肝脏的病理观察

3.3 血清酶学指标变化

3.4 血浆生化指标变化

3.5 肝脏抗氧化酶活性变化

3.6 脂质过氧化（LPO）的变化

4 讨论

4.1 微囊藻毒素对鲫肝脏系数的影响

4.2 微囊藻毒素对鲫肝脏的病理损伤

4.3 微囊藻毒素对鲫血液生化指标的影响

4.4 微囊藻毒素对鲫肝脏氧化损伤

第三节微囊藻毒素对鲫血液循环系统的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验鱼

2.2 染毒

2.3 外周血象指标测定

2.4 血液生化指标测定

2.5 肾脏显微结构样品制备与观察

2.6 生物信号采集系统

2.7 血压和心率数据的采集

2.8 主动脉血压的测定

2.9 循环血量的测定

2.10 肝脏毛细血管通透性测定

2.11 统计分析

3 结果

3.1 外周血象指标的变化

3.2 血浆生化指标的变化

3.3 肾脏的病理观察

3.4 动脉血压的变化

3.5 心率变化

3.6 循环血量变化

3.7 肝脏毛细血管通透性变化

4 讨论

4.1 微囊藻毒素对鲫血致贫血的毒性效应

4.2 微囊藻毒素对鲫血液循环系统的损伤

第三章微囊藻毒素对家兔的急性毒性研究

第一节微囊藻毒素对家兔致毒的行为观察

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验动物

50的测定'>2.2 LD₅₀的测定

2.3 染毒与采样

2.4 死亡率及行为观察

2.5 统计分析

3 结果

4 讨论

第二节微囊藻毒素对家兔肝脏的损伤

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 染毒

2.3 血液采样

2.4 肝组织采样及匀浆制备

2.5 血清酶学指标的测定

2.6 肝脏抗氧化酶活性的测定

2.7 肝脏脂质过氧化（LPO）含量的测定

2.8 统计分析

3 结果

3.1 血清酶活性的变化

3.2 肝脏抗氧化酶活性的变化

3.3 脂质过氧化（LPO）含量的变化

4 讨论

第三节微囊藻毒素对家兔血液循环系统的损伤

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 染毒及采样

2.3 血液采集及血象指标测定

2.4 骨髓电镜观察样品制备

2.5 动脉血压的测定

2.6 血压和心率数据的采集

2.7 循环血量测定

2.8 肝脏毛细血管通透性测定

2.9 统计分析

3 结果

3.1 血象指标的变化

3.2 骨髓细胞的透射电镜观察

3.3 动脉血压的变化

3.4 心率的变化

3.5 循环血量的变化

3.6 肝脏毛细血管通透性的变化

4 讨论

4.1 微囊藻毒素对家兔致贫血的毒性效应

4.2 微囊藻毒素对家兔骨髓细胞的损伤

4.3 微囊藻毒素对家兔血液循环系统的损伤

第四章微囊藻毒素对家兔的亚急性试验

第一节微囊藻毒素对家兔的肝脏损伤

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验动物

2.2 动物染毒与采样

2.3 血清样品及肝组织匀浆的制备

2.4 血清酶、肝脏抗氧化酶和脂质过氧化产物测定

2.5 统计分析

3 结果

3.1 血清酶活性的变化

3.2 肝脏抗氧化酶活性的变化

3.3 脂质过氧化产物（LPO）含量的变化

4 讨论

第二节微囊藻毒素对家兔血象指标及造血生长因子的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 染毒

2.2 血样采集与血清样品制备

2.3 外周血象指标测定

2.4 血清造血生长因子浓度测定

2.4.1 EPO浓度测定

2.4.2 IL-3和IL-6浓度测定

2.5 统计分析

3 结果

3.1 外周血象指标的变化

3.2 血清造血生长因子水平的变化

4 讨论

第三节微囊藻毒素对家兔骨髓细胞的损伤

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料及仪器

2.2 骨髓细胞样品制备

2.3 MTT法测定骨髓细胞增殖

2.4 骨髓嗜多染红细胞微核率观察

2.5 统计分析

3 结果

3.1 微囊藻毒素对家兔骨髓细胞增殖能力的影响

3.2 骨髓嗜多染红细胞微核率的变化

3.3 骨髓细胞的透射电镜观察

4 讨论

第五章研究小结及展望

1 小结

50和行为观察'>1.1 LD₅₀和行为观察

1.2 血清酶活性的变化

1.3 肝脏的氧化损伤

1.4 染毒动物贫血与主要造血器官的损伤

1.5 循环血量的下降与贫血

1.6 血压及心率变化

1.7 染毒动物死亡原因分析

1.8 微囊藻毒素对家兔造血机能的影响

2 研究展望

参考文献

致谢

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