论文摘要
γ-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在,是谷胱甘肽代谢的关键酶之一,随着生物技术发展的快速发展,利用γ-谷氨酰转肽酶制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。目前,本实验室筛选到一株γ-谷氨酰转肽酶高产菌株,并已探索了以菌体作为酶源催化合成茶氨酸的生产工艺。在此基础上,我们作了进一步的研究。目的以Bacillus licheniformis C12菌株为γ-谷氨酰转肽酶制备的菌种来源,通过对其产酶发酵条件优化、提取工艺、酶学性质及固定化该酶催化底物生产茶氨酸进行系统研究,为固定化该酶工业化生产茶氨酸打下基础。方法1.产酶发酵的诱导条件研究:采用底物诱导作用,通过不同底物（甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺）对菌体产酶发酵进行诱导,提高菌体的产酶量。2.酶的提取及酶学性质研究:采用溶菌酶法、反复冻融法、超声波法破碎细胞壁,高速冷冻离心后获得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液,经硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后,得到酶的提取物。采用γ-谷氨酰转肽酶常规测定方法检测其酶学性质。3.固定化酶制备及催化条件研究:采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法,制备固定化酶,通过正交试验对固定化酶条件进行优化。通过采取调整底物浓度、反应温度、pH以及添加酶促进剂提高固定化酶催化生产茶氨酸量,并采用正交试验得到最佳的固定化酶催化生产茶氨酸的工艺条件。结果1.产酶发酵的诱导条件研究:产酶发酵24h后添加谷氨酰胺至浓度5mmol/L,诱导2h后,其酶活力最高为7.0U/ml,是对照组的2.26倍。2.酶提取及酶学性质研究:菌体细胞破碎的较佳方法为溶菌酶破碎法,其操作条件选择为每克湿菌体加入2.5mg溶菌酶,35℃酶解20min,冷冻离心得粗酶液。再经过80-90%饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后,得到酶的提取物。该酶的最适pH为8.0,最适温度为45℃,γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应Km为0.73mmol/L。该酶在25-35℃的温度范围有较好的稳定性,在50℃的温度下保存20min酶活力基本丧失。该酶在碱性环境中比较稳定,酸性环境中很容易失活。在Ba2+,Mg2+,Ca2+等金属离子浓度为5mmol/L的情况下,对该酶的活力均有促进作用。3.固定化酶制备及催化条件研究:①固定化酶制备方法:采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法,取一定量的酶提取物,添加含量3.0%的海藻酸钠包埋,再添加0.25%戊二醛进行交联,交联时间2.5h。制备得到的固定化酶酶活回收率为70.8%。固定化酶的最适pH为9.0,与游离酶相比向酸性方向偏移1.0个单位;固定化酶的最适温度为37℃,比游离酶最适温度降低了8℃。γ-谷氨酰转肽酶经固定化后,热稳定性、酸碱稳定性和贮存稳定性都得到了提高。②固定化酶催化条件:研究了Mg2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的作用,通过正交试验确定Mg2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的较佳条件为2.0ml FDP发酵液/30ml转化液以及Mg2+浓度为3.0mmol/L。在此条件下固定化酶转化合成茶氨酸量为9.5g/L,相比对照组6.1 g/L提高了55.7%。固定化酶生产茶氨酸的操作稳定性比较差,反应九批次后,茶氨酸产量只有首批次的31.1%。结论本研究优化了产酶发酵条件,初步建立了来源于Bacillus licheniformis C12菌株的γ-谷氨酰转肽酶的提取纯化方法及了解了该酶的部分酶学性质。采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法,制备固定化γ-谷氨酰转肽酶,可用于生产茶氨酸。固定化酶酶活力与操作稳定性还有待进一步提高。