神经生长因子在人脑胶质瘤中的表达特点及其临床意义

论文摘要

研究目的：观察神经生长因子（NGF）在星形胶质瘤组织及脑脊液标本中的表达特点,探讨其在胶质瘤诊断及预后判断中的临床意义。并利用NGF在胶质瘤中特异性核转位的现象,以NGF为“载体”,125Ⅰ为“弹头”,制备细胞核靶向抗胶质瘤药物125Ⅰ-NGF并评价其对U251细胞的杀伤作用。研究方法：（1）收集94例星形胶质瘤组织及术前脑脊液标本,通过免疫组织化学染色观察NGF在胶质瘤细胞中的核阳性表达,并采用ELISA法定量检测胶质瘤组织及脑脊液中NGF的表达水平,进一步通过免疫印迹分析,观察胶质瘤组织及脑脊液中所表达的NGF的分子形式。收集患者临床资料,随访患者预后,分析NGF的核阳性表达与胶质瘤病理分级及预后的相关性。（2）为了探讨NGF的核阳性表达是否具有胶质瘤细胞特异性,进一步对颅内最常见的良性肿瘤——脑膜瘤进行NGF免疫组织化学染色并随访患者的复发情况。探讨NGF核阳性表达与Ki67和PR阳性表达及患者预后的相关性。（3）采用联结标记法将俄歇电子发射体125Ⅰ与NGF进行偶联得到125Ⅰ-NGF。通过平板克隆形成试验观察给药后U251细胞的增殖能力、流式细胞仪检测各细胞周期细胞比例、彗星试验及微核形成试验观察胶质瘤细胞DNA损伤情况,评价125Ⅰ-NGF对U251细胞的杀伤作用。研究结果：（1）NGF在星形胶质细胞瘤中高表达,分布于细胞浆及细胞核。在对照组脑组织中NGF主要定位于细胞浆。（2）Ⅲ-Ⅳ级星形胶质瘤中NGF和核阳性率为70.0%,显著高于Ⅰ-Ⅱ级星形胶质瘤（28.6%,P<0.05）。NGF核阳性率与胶质瘤病理分级正相关（r=0.307,P<0.05）。NGF核阳性率与Ki67阳性率正相关（r=0.526,P<0.05）。生存分析结果提示：在Ⅰ-Ⅱ级星形胶质瘤患者中,NGF核阳性及NGF核阴性表达患者的中位无进展生存期（PFS）分别为25和42月（P<0.05）。在Ⅲ-Ⅳ级星形胶质瘤患者中,NGF核阳性及NGF核阴性表达患者的PFS分别为7和24月（P<0.05）。（3）胶质瘤组织及脑脊液中NGF表达水平高于对照组,高级别胶质瘤中NGF表达水平高于低级别。在胶质瘤组织中存在13和36 kDa两种分子形式的NGF表达,但脑脊液中仅有单一分子形式的36 kDaNGF表达。NGF核阳性率与脑脊液中NGF表达水平正相关（r=0.755,P<0.01）。（4）NGF核阳性率与脑脊液中36 kDa NGF的表达量呈正相关（r=0.755,P<0.01）。NGF核阳性率与胶质瘤组织提取液中NGF含量无显著相关（r=0.159,P=0.125）。（5）Cox回归分析结果：胶质瘤病理分级、NGF核阳性表达及脑脊液中NGF表达量与胶质瘤患者预后显著相关（P<0.01）。（6）对脑膜瘤组织的NGF免疫组织化学染色结果表明：NGF在脑膜瘤中亦存在核阳性表达,NGF核阳性率与Ki67阳性率正相关（r=0.741,P<0.01）,与PR阳性率呈负相关（r=-0.59,P<0.01）。NGF核阳性及NGF核阴性组患者的PFS分别为36±2.484和59±2.295月,差异具有显著性（P<0.01）。（7）通过联结标记法将放射性核素125Ⅰ与NGF偶联得到的产物125I-NGF在体外性质稳定,对U251细胞的最低有效浓度为：592kBq/ml。在此浓度下,125Ⅰ-NGF可以进入细胞核,损伤靶细胞DNA。125I-NGF处理组U251细胞克隆形成率（0.02±0.01）显著低于对照组（0.33±0.02）（P<0.01）。流式细胞仪分析结果提示：125I-NGF处理组U251细胞S期细胞比例为10.69±0.02,较对照组35.47±0.02显著下降（P<0.01）。结论：（1）尽管NGF核阳性表达不具有胶质瘤细胞特异性,在脑膜瘤等良性脑肿瘤中亦呈核阳性表达,但NGF核阳性表达均与Ki67阳性率正相关,与患者不良预后密切相关。NGF核阳性表达作为反映肿瘤细胞增殖活性的指标。（2）胶质瘤患者脑脊液中NGF表达水平与NGF核阳性表达及患者预后密切相关。由于脑脊液取材方便,可以反复取材。结合影像学检查结果,动态监测脑脊液中NGF表达水平可以反映胶质瘤病情活动性及治疗效果。（3）根据NGF在胶质瘤、脑膜瘤等高增殖肿瘤细胞中特异性核表达的特点,以NGF为“载体”,偶联俄歇电子发射体125Ⅰ为“弹头”制备的细胞核靶向化疗药物125I-NGF可以特异性杀伤S期U251细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 背景知识
• 1.1 神经生长因子及其受体结构
• 1.2 神经生长因子受体信号转导
• 1.2.1 第二信号系统通路
• 1.2.2 信号内体通路
• 1.3 神经生长因子前体及信号转导
• 1.3.1 神经生长因子前体
• 1.3.2 pro-NGF的受体及信号转导
• 1.4 NGF及其受体在胶质瘤中的表达
• 1.5 NGF及其受体的核转位
• 2. 本论文研究的目的、意义、方法和实验方案的设计
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究意义
• 2.3 研究方法和技术
• 2.4 技术路线
• 第二章 本课题相关的研究进展
• 1. 神经生长因子及其受体与神经系统肿瘤研究进展
• 1.1 NGF及其受体与神经系统原发肿瘤
• 1.1.1 神经母细胞瘤
• 1.1.2 髓母细胞瘤
• 1.1.3 垂体瘤
• 1.1.4 胶质瘤
• 1.2 NGF及其受体与神经系统转移肿瘤
• 1.2.1 胰腺癌的沿神经鞘转移
• 1.2.2 其他肿瘤的脑转移
• 1.3 NGF及其受体亚细胞定位及其生物学意义
• 2. 胶质瘤靶向治疗研究进展
• 2.1 单克隆抗体制剂
• 2.2 信号通路抑制剂
• 2.3 凋亡诱导制剂
• 2.4 肿瘤转移抑制剂
• 2.5 胶质瘤诱导分化
• 2.6 基于俄歇电子的细胞核靶向放射治疗
• 3. 常用的蛋白质放射性碘标记方法的原理及优缺点
• 3.1 氯胺T法
• 3.2 乳过氧化物酶法
• 3.3 Iodogen碘化法
• 3.4 酰化试剂（Bolton-Hunter试剂）法
• 第三章 本课题的前期研究基础
• 1. 细胞周期不同时相细胞内NGF及P-TRKA的分布特点
• 2. NGF抗血清中和试验结果
• 3. 免疫印迹结果
• 4. 结论
• 第四章 NGF在星形胶质瘤组织及脑脊液中的表达及临床意义
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要溶液
• 1.1.4 研究对象
• 1.1.4.1 胶质瘤患者基本信息
• 1.1.4.2 胶质瘤患者入选及排除标准
• 1.1.4.3 星形胶质瘤手术切除程度评分
• 1.1.4.4 胶质瘤患者KPS评分
• 1.2 方法
• 1.2.1 石蜡切片及免疫组织化学染色
• 1.2.1.1 石蜡切片
• 1.2.1.2 石蜡切片脱蜡
• 1.2.1.3 抗原热修复
• 1.2.1.4 免疫组织化学染色
• 1.2.1.5 苏木素复染细胞核
• 1.2.1.6 脱水、透明、封片
• 1.2.1.7 免疫组织化学染色结果的观察及判定
• 1.2.2 星形胶质瘤组织提取液及脑脊液样品的准备
• 1.2.3 ELISA测定
• 1.2.4 免疫印迹分析
• 1.2.5 星形胶质瘤患者预后随访
• 1.2.6 统计分析
• 2. 实验结果
• 2.1 影像检查及HE染色结果
• 2.2 免疫组织化学染色结果
• 2.2.1 NGF,Ki67和GFAP表达情况
• 2.2.2 NGF核阳性率与星形胶质瘤病理分级和患者预后的关系
• 2.3 胶质瘤组织提取液和脑脊液中NGF的表达
• 2.4 胶质瘤患者脑脊液中NGF表达量与切片中NGF核阳性率的相关性
• 2.5 胶质瘤患者预后相关因素的Cox回归分析
• 3. 讨论
• 第五章 神经生长因子在脑膜瘤细胞核中表达及其临床意义
• 1. 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要溶液
• 1.1.4 研究对象
• 1.2 方法
• 1.2.1 石蜡切片及免疫组织化学染色
• 1.2.1.1 石蜡切片
• 1.2.1.2 石蜡切片脱蜡
• 1.2.1.3 抗原热修复
• 1.2.1.4 免疫组织化学染色
• 1.2.1.5 苏木素复染细胞核
• 1.2.1.6 脱水、透明、封片
• 1.2.2 免疫组织化学染色结果的观察及判定
• 1.2.3 统计分析
• 2. 结果
• 2.1 NGF核阳性率与脑膜瘤病理类型的关系
• 2.2 NGF与Ki67阳性率的相关性
• 2.3 NGF与PR阳性率的相关性
• 2.4 NGF核阳性率与脑膜瘤患者预后的关系
• 3. 讨论
• 125Ⅰ与神经生长因子的偶联及条件优化'>第六章 放射性核素¹²⁵Ⅰ与神经生长因子的偶联及条件优化
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要溶液
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 125Ⅰ与NGF的偶联'>1.2.1¹²⁵Ⅰ与NGF的偶联
• 125Ⅰ-NGF体外稳定性试验'>1.2.2¹²⁵Ⅰ-NGF体外稳定性试验
• 1.2.3 统计分析
• 2. 实验结果
• 3. 结论
• 125Ⅰ-NGF对U251细胞杀伤作用的初步研究'>第七章¹²⁵Ⅰ-NGF对U251细胞杀伤作用的初步研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要溶液配制
• 1.2 方法
• 125Ⅰ-NGF最低有效浓度确定'>1.2.1¹²⁵Ⅰ-NGF最低有效浓度确定
• 1.2.2 平板克隆形成试验
• 1.2.3 放射自显影
• 1.2.4 微核形成试验
• 1.2.5 彗星试验
• 1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期分布
• 1.2.7 统计分析
• 2. 实验结果
• 125Ⅰ-NGF放射性浓度变化关系'>2.1 U251细胞OD值随¹²⁵Ⅰ-NGF放射性浓度变化关系
• 2.2 平板克隆形成试验
• 2.3 放射自显影
• 2.4 微核形成试验
• 2.5 彗星试验
• 2.6 细胞周期分布
• 3. 讨论
• 第八章 主要结论和展望
• 1. 主要结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 附录
• 星形胶质瘤患者随访数据
• 脑膜瘤患者随访数据
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文