CUEDC2各种缺失突变体的构建及其功能初探

论文摘要

CUEDC2是一个未知功能的蛋白（GeneBank：NM024040），在NCBI数据库没有与其功能相关的研究论文。本室其他同学在以往的研究中利用酵母双杂交筛选出CUEDC2与PRB存在相互作用，并且发现CUEDC2能够促进PRB的泛素化降解，为研究CUEDC2的功能提供了线索。本室其他同学利用CUEDC2作为诱饵进行酵母双杂交筛选中鉴定了多个阳性克隆，其中两个编码IKKβ。为了验证酵母双杂交的结果，以及确定CUEDC2与IKKβ的相互作用区域，我们首先在GST载体上构建了许多CUEDC2的缺失突变。由于CUEDC2只含有CUE结构域，因此初步构建了CUEDC2的C末端和N末端以及包含和不包含CUE结构域的突变体。之后为了确定CUEDC2影响NF-κB信号通路的具体区域，又进一步将CUEDC2的各种缺失突变构建到pCDNA3.0-Flag载体上。并构建了IKKβ的一些缺失突变。其次，我们利用体外的GST pull-down实验验证了CUEDC2与IKKβ之间的相互作用。我们发现CUEDC2与IKKα之间也存在相互作用。随后，我们利用CUEDC2的缺失突变，通过体外GST pull-down实验确定CUEDC2与IKKα的结合位点在CUEDC2的C末端。由于IKK是NF-κB信号通路中非常重要的蛋白，我们推测CUEDC2会影响NF-κB的转录活性。为确定CUEDC2和IKKα／β相互作用的生物学意义，我们在真核细胞中建立了一套NF-κB转录激活荧光素酶报告检测系统。测活结果发现，过表达CUEDC2可以特异地抑制TNFα刺激的NF-κB转录活性。这一现象在Hela细胞中得到了验证。我们用IL-1β刺激HEK293细胞，发现CUEDC2也能够抑制IL-1β刺激的NF-κB转录活性。在稳定转染CUEDC2的HEK293细胞中，我们发现TNFα和IL-1β对NF-κB的转录激活相比空载体组明显降低。为了确定CUEDC2在哪个水平抑制NF-κB信号通路，我们在293T细胞中共转CUEDC2与NF-κB信号通路的许多成员如MEKK1，IKKβ，持续激活型IKKβ，p65，通过此实验确定CUEDC2抑制NF-κB转录活性是在IKK水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 克隆构建及表达检测
• 材料与方法
• 1.材料及来源
• 1.1 细胞株、菌株及质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 细胞培养试剂
• 1.4 抗体
• 1.5 大型仪器
• 2.实验方法
• 2.1 GST-CUEDC2缺失突变表达载体的构建及鉴定
• 2.1.1 GST-CUEDC2缺失突变表达载体的引物设计
• 2.1.2 PCR扩增目的片段
• 2.1.3 酶切PCR产物和载体
• 2.1.4 连接
• 2.1.5 大肠杆菌的转化
• 2.1.6 质粒提取、酶切片段的鉴定
• 2.2 Flag-CUEDC2各种缺失突变表达载体的构建及鉴定
• 2.3 IKKβ缺失突变表达载体的构建及鉴定
• 2.4 3×Flag-CUEDC2和3×Flag-PP1的构建
• 2.5 细胞转染
• 2.6 Western blot分析
• 结果与讨论
• 1.GST-CUEDC2缺失突变表达载体的鉴定
• 2.Flag-CUEDC2缺失突变表达载体的酶切鉴定及表达鉴定
• 2.1 Flag-CUEDC2缺失突变表达载体的鉴定
• 2.2 Flaz-CUEDC2缺失突变在293T细胞中表达鉴定
• 3.IKKα和IKKβ缺失突变表达载体的酶切鉴定及表达鉴定
• 3.1 IKKα和IKKβ缺失突变表达载体的鉴定
• 3.2 IKKα和IKKβ缺失突变表达载体在293T细胞中表达的鉴定
• 4.3×Flaz-CUEDC2和3×Flag-PP1表达载体的鉴定
• 小结
• 第二部分 CUEDC2与IKKα/β的相互作用及相互作用区域
• 材料与方法
• 1 试剂、材料及仪器
• 1.1 质粒、菌株、细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 细胞培养试剂
• 1.4 抗体
• 1.5 大型仪器
• 2.实验方法
• 2.1 293T细胞瞬时转染
• 2.2 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.3 GST沉淀（pull-down）分析
• 结果与讨论
• 1.GST pull-down验证CUEDC2与IKKα/β相互作用
• 2 GST-CUEDC2融合蛋白的诱导表达与纯化
• 3.GST pull-down实验确定CUEDC2与IKKα的相互作用区域
• 4.CUEDC2与IKKα相互作用示意图
• 小结
• 第三部分 CUEDC2抑制TNFα及IL-1激活对NF-κ B通路
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株、质粒
• 1.2 试剂及仪器
• 2方法
• 2.1 细胞转染
• 2.2 荧光素酶活性测定
• 2.3 Western blot分析
• 结果与讨论
• 1.CUEDC2过表达抑制TNFα和IL-1β对NF-κ B的转录激活
• 1.1 293T细胞中CUEDC2过表达抑制TNFα对NF-κ B转录激活
• 1.2 Hela细胞中CUEDC2过表达抑制TNFα对NF-κ B转录激活
• 1.3 过表达CUEDC2抑制IL-1β对NF-κ B的转录激活
• 2.稳定转染CUEDC2的细胞中TNFα和IL-1β对NF-κ B的转录激活
• 3.CUEDC2在IKK水平影响NF-κ B转录活性
• 4.CUEDC2对持续激活型IKKβ刺激的NF-κ B转录活性没有影响
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 英文缩略词
• 文章交流与发表