SARS-CoV N蛋白与细胞色素P450（CYP4F3）相互作用的研究

论文摘要

N蛋白是SARS冠状病毒（SARS-CoV）的主要结构蛋白之一，与病毒RNA结合形成核衣壳，能够诱导强烈的细胞免疫和体液免疫，是SARS冠状病毒主要的抗原分子，在SARS的诊断和预防上具有重要的应用。已有的研究表明，SARS-CoV N蛋白参与SARS冠状病毒RNA合成的调控以及核衣壳的形成，并能结合人亲环素（hCypA）解离病毒核心，激活AP-1信号转导途径，导致蛋白质类泛素化，从而干扰宿主细胞分裂，在生长因子缺乏的情况下诱导细胞凋亡。在我们的前期工作中，发现将表达N蛋白的质粒和表达S蛋白的质粒共同免疫家兔后，家兔的SARS样炎症反应比单注射表达S蛋白质粒明显加重，提示N蛋白在SARS的发病中有增强炎症反应的作用。为了研究N蛋白参与炎症反应的分子机理，以全长SARS-CoV N蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交筛选人胎肝cDNA文库时，发现细胞色素P450（CYP4F3）有可能与SARS-CoV N蛋白相互作用。本研究通过一系列免疫沉淀、免疫印迹以及体外结合、BIACORE等实验证明，CYP4F3与SARS-CoV N蛋白在体内外均能直接结合形成复合物，CYP4F3与SARS-CoV N蛋白的N端和C端均有结合，两种蛋白的亲和常数KD=4.3×10-11，大于抗原-抗体的亲和力(抗原-抗体的亲和常数大约为1010)。进一步的研究发现，SARS-CoV N蛋白与CYP4F3结合可以抑制CYP4F3的ω-羟化酶活性，从而抑制炎症因子LTB4的降解。另外，还对临床SARS病例血清样本LTB4进行了检测，结果发现，SARS病人早期血清LTB4水平明显高于发病10天以后，而且SARS病人的LTB4水平远远高于普通肺炎病人。这些都从临床角度进一步验证了我们的实验结果。本研究为SARS致病机理的进一步研究提供了重要线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.SARS的病原体——SARS冠状病毒（SARS-CoV）
• 2.SARS-CoV N蛋白
• 3.SARS-CoV的致病机理
• 4.细胞色素P450概述
• 5.CYP4F3的结构和功能
• 6.课题研究的目的、方法及意义
• 材料与方法
• 1.菌株、细胞株及质粒
• 2.工具酶及缓冲液
• 3.培养基
• 4.试剂及试剂盒
• 5.主要仪器设备
• 6.载体构建、引物合成及测序
• 7.酵母GS115宿主菌感受态细胞的制备
• 8.电击转化酵母GS115感受态细胞
• 9.MD和MM平板筛选
• 10.原位双层膜筛选
• 11.高效分泌表达菌株筛选
• 12.转染质粒的制备
• 13.细胞培养与转染
• 14.谷胱甘肽S转移酶（glutathion S-transferase,GST）融合蛋白珠子的制备
• 15.免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）与免疫印迹（Immunoblot,IB）
• 16.体外结合实验
• 17.BIACORE检测动力学常数
• 18.高压液相色谱
• 4检测'>19.白三烯B₄检测
• 20 其它
• 结果
• 1.细胞色素P450（CYP4F3）在毕赤酵母中的表达
• 2.细胞色素P450（CYP4F3）在哺乳动物细胞中的表达及纯化
• 3.SARS-CoV N蛋白与细胞色素P450（CYP4F3）之间存在相互作用
• 4.体外高盐状态下SARS-CoV N蛋白抑制细胞色素P450（CYP4F3）的降解
• 5.SARS-CoV N蛋白抑制细胞色素P450（CYP4F3）的羟化酶活性
• 4水平显著升高'>6.SARS病人血清中LTB₄水平显著升高
• 讨论
• 1.SARS-CoV N蛋白与细胞色素P450（CYP4F3）的相互作用
• 2.SARS-CoV N蛋白抑制CYP4F3的羟化酶活性
• 3.细胞色素P450（CYP450）的基因多态性
• 4.后续还应进行的工作
• 总结
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 缩略词表
• 硕士期间发表的论文综述（第一署名）
• 致谢