日本血吸虫雌雄合抱相关蛋白的分离、鉴定及其DNA疫苗的研究

论文摘要

研究目的血吸虫病是一个严重的全球性公共卫生问题，全球每年超过6亿人口受到血吸虫感染的威胁，约2亿人口被感染。目前，控制血吸虫病的主要策略是用安全有效的药物对感染人群进行化疗，但化疗并不能预防人群的反复再感染，致使疫情易于反弹。当前，国家提出现阶段以控制传染源为主的综合防治新策略，对于湖区血吸虫病疫情的控制将起到重要的作用。日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）的一个显著特点是雌雄异体但又终生合抱。雌雄合抱是血吸虫生长发育、成熟、产卵的前提，而虫卵是造成病理损害和病原体传播的关键因素。阻断传播型抗血吸虫卵胚发育和抗雌虫生殖产卵的研究，一直是本课题组的重要攻关内容。在1999年-2000年我国总理基金血防重点项目结题后进行的全国血吸虫疫苗免疫保护统一检测实验中，由本室构建的天然分子疫苗（1号疫苗）在全国16种候选疫苗中获得了最佳的动物保护效果。本文在此研究基础上，利用双向电泳和质谱技术，鉴定了9个日本血吸虫雌雄合抱相关蛋白，从中选用编码血吸虫雌雄合抱相关蛋白SJCHGC基因为疫苗候选分子，进行克隆、表达及DNA疫苗构建，以考核其作为抗日本血吸虫病疫苗候选分子的潜在价值，为抗日本血吸虫雌雄合抱和抗生殖疫苗的制备及应用提供实验依据。研究方法1)利用双向凝胶电泳和MALDI-TOF质谱分析等蛋白质组学方法，对比研究了日本血吸虫雄虫在合抱与未合抱状态下蛋白质表达上的差异，并在mRNA水平进行进一步验证。2)采用生物信息学等技术对获得的日本血吸虫雌雄合抱相关蛋白SJCHGC（Sj22.7）编码基因序列进行开放阅读框（ORF）的寻找，编码氨基酸的推导，蛋白质同源性比较以及二、三级结构的预测。3)通过用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒pEGFP-C1／SJCHGC转染COS-7细胞，用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1／SJCHGC融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。4)用PCR特异性扩增SJCHGC基因，将其克隆入真核表达载体pcDNA3，构建DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC，并通过PCR、双酶切及测序鉴定。将pcDNA3／SJCHGC经脂质体转染Hela细胞，检测SJCHGC蛋白的体外瞬时表达。免疫接种并攻击感染小鼠，检测重组质粒在小鼠肌肉组织中的表达情况，以减虫率、减卵率和每雌肝卵数评价其免疫保护性。5)用DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC免疫接种并攻击感染小鼠，通过ELISA法测定血清中总IgG抗体水平，并以Western blot分析抗SJCHGC特异性抗体。四甲基偶氮唑盐试验（MTT法）检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应。攻击感染后以脾细胞培养法检测经血吸虫雄虫可溶性抗原（AWAm）刺激后，小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平。研究结果1．采用2-DE和质谱技术分离、鉴定Sj雌雄合抱差异表达蛋白利用双向凝胶电泳和MALDI-TOF质谱分析，获得重复性和分辨率较好的双向凝胶电泳图谱。质谱分析了11个差异表达蛋白质点，获得11个点的肽质量指纹图，通过查询数据库成功鉴定了9个血吸虫雌雄合抱相关蛋白质，大多数差异表达蛋白质功能涉及血吸虫的生长发育、生殖、营养、运动、信号传递等过程。2．Sj雌雄合抱相关蛋白新基因SJCHGC编码蛋白结构与功能分析通过Internet在线分析和生物信息学软件分析，对新基因SJCHGC的结构和功能有了进一步的认识，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22.76kDa，等电点为4.84。SJCHGC的编码蛋白含有2个Efh（EF-hand）保守结构功能域，即钙结合基序，属于钙传感器和钙调节基因的超家族成员。功能位点分析显示含有多个磷酸化位点，可能为一重要的胞浆内信号转导分子；基因结构及抗原表位分析显示，该基因具有较好的抗原性。3．pEGFP-C1／SJCHGC真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达定位在空载体pEGFP-C1转染组中，COS-7细胞内绿色荧光弥散分布于整个细胞；重组质粒pEGFP-C1／SJCHGC转染组中，绿色荧光分布在细胞胞浆中。RT-PCR结果示，pEGFP-C1／SJCHGC转染的COS-7细胞在622bp处有一条带，而用空质粒pEGFP-C1转染的COS-7细胞未出现条带，表明pEGFP-C1／SJCHGC转染细胞中有SJCHGC基因转录。Western blot的结果也确证了pEGFP-C1／SJCHGC融合蛋白的表达。4．SJCHGC DNA疫苗的构建、表达及免疫保护性研究经PCR、双酶切及测序鉴定结果证明，成功构建了SJCHGC真核表达重组质粒pcDNA3／SJCHGC。pcDNA3／SJCHGC可在Hela细胞中特异性表达SJCHGC蛋白，并能在小鼠肌肉组织细胞中表达，其表达蛋白能被血吸虫AWAm免疫兔血清识别。免疫保护效果测定显示，DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC免疫小鼠后获得了29.70％的减虫率、47.25％肝减卵率、51.77％肠减卵率以及25.90％每雌肝减卵率，具有明显的抗雌虫生殖能力。5．DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC免疫效应机制初探免疫后4周pcDNA3／SJCHGC组小鼠血清中IgG抗体水平开始升高。ELISA法和Western blot示免疫小鼠产生了抗SJCHGC特异性IgG抗体。用AWAm刺激免疫小鼠脾细胞，有明显的T细胞增殖反应。攻击感染后用AWAm刺激，pcDNA3／SJCHGC组脾细胞产生较高水平的Th1型细胞因子IFN-γ，而产生的Th2型细胞因子IL-4水平较其它组低。结论1)建立了日本血吸虫合抱前后雄虫双向凝胶电泳图谱，并应用质谱技术成功鉴定了9个血吸虫雄虫合抱相关的差异表达蛋白质，其功能涉及血吸虫的生长发育、生殖、营养、运动、信号传递等过程。为血吸虫蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据，为揭示日本血吸虫雌雄合抱的机制提供新的线索和思路。2)生物信息学分析示：SJCHGC的编码蛋白含有2个Efh（EF-hand）保守结构功能域，即钙结合基序，属于钙传感器和钙调节基因的超家族成员，存在多个潜在抗原表位与特定功能位点，可能为一重要的胞浆内信号转导分子。属首次发现并报导的与日本血吸虫雌雄合抱相关的蛋白质，进一步研究其功能具有重要的生物学意义。3)重组质粒pEGFP-C1／SJCHGC转染COS-7细胞，可用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1／SJCHGC融合蛋白在COS-7细胞中的表达和胞浆中亚细胞定位，细胞所表达的融合蛋白具有血吸虫抗原性，为该基因功能研究提供了线索。4) DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC可诱导小鼠产生较显著的抗血吸虫攻击感染的免疫保护力，减虫率为29.70％，肝减卵率为47.25％，肠减卵率为51.77％，每雌肝减卵率为25.90％，具有明显的抗雌虫生殖能力。提示，该核酸疫苗可作为新的有效抗血吸虫病疫苗候选分子。5)体液免疫和细胞免疫应答共同参与了DNA疫苗pcDNA3／SJCHGC诱导的保护性免疫作用，其中Th1型优势免疫应答在抗日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 前言
• 技术路线
• 第一章 采用2-DE和质谱技术分离、鉴定日本血吸虫雌雄合抱差异表达蛋白
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二章 日本血吸虫雌雄合抱相关蛋白新基因SJCHGC编码蛋白结构与功能分析
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第三章 pEGFP-C1/SJCHGC真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达定位
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第四章 日本血吸虫SJCHGC DNA疫苗的构建、表达及免疫保护性研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第五章 DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC免疫效应机制初探
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 2-DE差异蛋白质点的质谱分析结果
• 附录2 基因测序图
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果