论文摘要
骨髓间充质干细胞以其具有多向分化潜能、来源充足、体外易扩增、无免疫排异等优点,成为再生医学细胞移植治疗重要的种子细胞。然而,大量动物实验和临床研究均显示,移植的骨髓间充质干细胞存活率很低,限制了此方法的临床治疗效果。本研究组先前的研究表明,体外以缺氧无血清条件模拟缺血心肌微环境能够引起骨髓间充质干细胞凋亡;进一步研究发现洛伐他汀、溶血磷脂酸能够对抗缺氧无血清引起的骨髓间充质干细胞凋亡,而阿斯匹林具有抑制骨髓间充质干细胞增殖的作用。本论文旨在研究常用抗炎药物对骨髓间充质干细胞存活的影响及相关机制,探讨阿司匹林/糖皮质激素对骨髓间充质干细胞凋亡的影响,并着重研究了线粒体凋亡途径和Wnt/β-catenin、ERK、Akt等信号通路在其中的调节作用。本论文主要包括以下研究内容:一、阿司匹林对骨髓间充质干细胞凋亡的影响及相关机制1.研究阿司匹林对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。2.研究阿司匹林诱导骨髓间充质干细胞凋亡过程中,线粒体/caspase-3途径和Wnt/β-catenin信号通路成员变化。3.研究Wnt/β-catenin信号通路是否调节阿司匹林诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。二、糖皮质激素对缺氧无血清诱导骨髓间充质干细胞凋亡的影响及相关机制1.研究糖皮质激素对缺氧无血清诱导骨髓间充质干细胞凋亡的影响。2.研究ERK1/2和Akt是否参与糖皮质激素抗缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。3.研究糖皮质激素是否抑制缺氧无血清刺激骨髓间充质干细胞炎症因子的表达及其与抗凋亡作用的关系。本论文主要采用的研究方法:使用SD大鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用Hoechst 33342和AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪技术检测细胞凋亡。Western免疫印迹法检测蛋白表达和蛋白磷酸化表达。实时定量PCR技术检测mRNA的表达。Caspase-3色度检测试剂盒检测caspase-3酶活。本论文研究结果:阿司匹林诱导骨髓间充质干细胞凋亡率增高,凋亡小体增加,促进线粒体细胞色素c释放和caspase-3激活。阿司匹林以磷酸化水平降低的方式促进GSK-3β的活化和抑制β-catenin的入核,降低Wnt/β-catenin信号通路靶基因细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达,提示阿司匹林抑制Wnt/β-catenin信号通路。采用Wnt 3a和GSK-3β抑制剂（LiC1和SB 216763）模拟激活Wnt/β-catenin信号通路,促进了细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表达,抑制了阿斯匹林诱导的骨髓间充质干细胞凋亡,保护线粒体功能阻抑细胞色素c释放和caspase-3的激活。阿斯匹林时间依赖性地降低环氧化酶-2（COX-2）的表达,而后促进COX-2的表达上调,激活Wnt/β-catenin信号通路进一步诱导COX-2的表达,而COX-2抑制剂NS-398抑制COX-2的表达上调,进一步促进了阿斯匹林诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡。说明Wnt/β-catenin信号通路促进cyclin D1和COX-2表达,通过线粒体/caspase-3凋亡通路调节阿斯匹林诱导骨髓间充质干细胞凋亡。天然糖皮质激素之一氢化可的松抑制缺氧无血清引起的骨髓间充质干细胞caspase-3激活和凋亡率增高。氢化可的松以磷酸化水平增高的方式促进ERK1/2和Akt的活化,而ERK1/2抑制剂U0126和PI3K/Akt抑制剂Wortmanin拮抗氢化可的松阻抑caspase-3激活的作用;以浓度依赖性的方式抑制炎症因子IL-1β、TNF-α的表达,但在抑制作用较弱的低浓度(10-10mol/L)和抑制作用较强的高浓度(10-6mol/L)具有类似的抗凋亡作用。说明氢化可的松抗缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。ERK1/2和Akt可能参与调节氢化可的松抗凋亡作用。另外,研究结果还提示了氢化可的松抑制炎症因子表达作用与抗凋亡作用没有相关性。综上所述,Wnt/β-catenin信号通路通过线粒体/caspase-3凋亡通路调节调节阿斯匹林诱导骨髓间充质干细胞凋亡。ERK1/2、Akt参与氢化可的松抗缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。我们的研究结果提示在特定的环境下,如长期常规较大剂量服用阿司匹林治疗,阿斯匹林会影响骨髓间充质干细胞的存活,因此在患有慢性炎症如风湿性关节炎的病人,接受骨髓间充质干细胞移植治疗的时候,需谨慎服用阿司匹林,而同样具有抗炎作用的糖皮质激素可作为替代治疗的候选药物之一。
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