论文摘要
在神经系统肿瘤中,胶质瘤是最常见的恶性肿瘤,其因侵袭性强,恶性度高,容易复发,治疗效果往往很差。目前可以采用常规的治疗方法主要有手术、放疗、化疗、中医学辅助治疗等,但副作用大,疗效甚微。近几年随着对肿瘤的认识不断提高,基因治疗随之孕育而出。基因治疗有其对肿瘤的选择性强,损伤小而轻,对晚期肿瘤或转移瘤灶仍有效等特点,越来越受到人们的重视。条件复制型腺病毒即肿瘤特异性增殖型腺病毒,目前多用于肿瘤的基因治疗当中。条件复制型腺病毒有通过直接杀死感染的肿瘤细胞,增强肿瘤免疫反应,可使携带的外援基因大量表达及对周围正常细胞损伤小等特点,所以越来越成为基因治疗中的热点之一本次研究是COX-2启动子携带条件复制性腺病毒对脑胶质瘤细胞生长的抑制的研究,分为如下五部分：1.COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒的构建及鉴定目的：构建COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒,为今后利用Ad-COX-2-E1A治疗脑胶质瘤奠定基础。方法：(DpRsetB-E1A原核表达质粒的构建；②重组E1A蛋白的表达和纯化；③多克隆抗体的制备和抗体检测；④实验细胞COX-2的表达水平的检测；⑤重组腺病毒质粒的构建及鉴定。结果：①E1蛋白能够被有效表达,anti-E1A多克隆抗体滴度很高；②通过流式细胞仪和RT-PCR 2种方法,在脑胶质瘤细胞A-172、LN。18中均检测到了较高水平的Cox-2活性：③成功构建了重组腺病毒Ad-Cox-2-E1A,并从基因和蛋白水平对其进行了鉴定。结论：Ad-Cox-2-E1A被成功构建并具有良好的表达活性,可以作为今后胶质瘤基因治疗的良好载体。2.重组条件复制性腺病毒的获得目的：通过克隆、包装、扩增、纯化得到Cox-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒。方法：①重组腺病毒质粒的构建；②重组腺病毒的包装和扩增；③重组腺病毒的纯化；④重组腺病毒的鉴定结果：①通过PCR方法,得到大量重组腺病毒质粒；②成功包装、扩增、纯化重组条件复制性腺病毒。③重组腺病毒的鉴定显示重组腺病毒片段没有丢失,外源基因表达正常。结论：Ad-Cox-2-E1A被成功大量获得,外源基因表达正常,可以用于后续实验3.Cox-2启动子在人脑胶质瘤细胞中的特异性启动目的：用重组腺病毒感染人脑胶质瘤细胞及人脑正常成纤维细胞,检测Cox-2启动子在腺病毒载体上在脑胶质瘤细胞中的启动特异性。方法：通过荧光素酶报告基因原理,测得Cox-2启动子在实验细胞中的启动活性。结果：Cox-2启动子在正常细胞中基本没有检测到启动活性,在脑胶质瘤细胞中Cox-2启动子具有高启动活性。结论：在腺病毒载体中Cox-2启动子在正常脑成纤维细胞中不具有启动特异,这对于其所携带的基因只在肿瘤细胞中特异性表达,从而达到比较好的治疗作用,同时降低对于周围细胞的副作用奠定了基础。4.在体外Ade-Cox-2-E1对于人脑胶质瘤细胞的特异性杀伤目的：用重组腺病毒Ad-COX-2-E1A感染人脑胶质瘤细胞及人脑正常成纤维细胞,通过检测细胞存活率检测条件复制性腺病毒对于脑胶质瘤细胞的特异性杀伤。方法：①通过Western检测Ade-Cox-2-E1感染肿瘤细胞E1A蛋白的特异性表达；②通过用MTT法检测Ade-Cox-2-E1对于肿瘤细胞生长的特异性抑制。结果：①重组腺病毒Ad-Cox-2-E1感染实验用细胞,在正常细胞中基本上检测不到E1A蛋白的表达,而在脑胶质瘤细胞中能够检测到E1A蛋白的表达。②重组腺病毒对脑正常细胞的生长没有明显的抑制作用,对于脑胶质瘤细胞具有比较好的特异性抑制活性。结论：重组腺病毒既保留了野生型腺病毒的高感染性的特点,又实现了在脑胶质瘤细胞中的特异性复制,从而大大降低了其对于周围正常细胞的副作用。5.在体内Ade-Cox-2-E1对于人脑胶质瘤细胞的抑制作用目的：用重组腺病毒Ad-COX-2-E1A在肿瘤局部注射,通过检测肿瘤生长曲线检测在BalB/c裸鼠体内对于人脑胶质瘤细胞A-172的抑制作用。方法：①采用BalB/C裸鼠设计肿瘤模型；②通过与对照组肿瘤体积变化的对比显示Ade-Cox-2-E1对于荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制；③通过病理切片观察Ad-Cox-2-E1对于荷瘤裸鼠主要脏器的影响。结果：①成功构建BalB/C裸鼠胶质瘤模型；②实验组对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显的抑制作用,且Ad-Cox-2-E1组与wAd组相比,从第22天开始,肿瘤体积没有显著性差异,抑瘤效果均很明显。③病理切片示对于肝、肾组织无明显毒副作用。结论：Ade-Cox-2-E1A重组腺病毒有效地抑制了裸鼠体内的人脑胶质瘤细胞的生长,但对周围重要脏器无明显毒副作用。
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相关论文文献
- [1].COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)的构建及鉴定[J]. 中国老年学杂志 2010(24)
- [2].选择复制性腺病毒M4对卵巢癌细胞系OV2008的体外治疗作用及初步机制探讨[J]. 现代妇产科进展 2011(06)
- [3].溶瘤腺病毒的安全性研究进展[J]. 中国癌症防治杂志 2015(01)
- [4].条件复制腺病毒携带白细胞介素24增强Hela细胞放射敏感性[J]. 现代肿瘤医学 2015(09)
标签：条件复制性腺病毒论文; 基因治疗论文; 启动子论文; 胶质瘤论文;