RNA沉默抑制子p25在瞬时表达体系中的沉默抑制作用及其抗血清制备

论文摘要

RNA沉默（RNA silencing）是一种依赖核酸序列特异性的抗病毒防御机制。而针对寄主的这一防御机制,许多病毒演化出相应的克服抗性的RNA沉默抑制子。利用农杆菌介导的瞬时表达体系表达外源蛋白时,往往在侵染2-3天后外源蛋白表达水平就开始下降,实际上,转录后基因沉默即RNA沉默是导致无效性的主要原因,因此利用农杆菌共同转化RNA沉默抑制子基因和目的基因将提高目的蛋白的表达水平。本研究中,将PVX编码的p25及TBSV编码的p19两种抑制子分别和迷迭香酸合成途径中的关键酶之一——羟基苯丙酮酸酯还原酶（HPPR）基因共侵染,分析RNA沉默抑制子对瞬时表达引起的基因沉默的抑制作用,并初步探讨了彩叶草叶片中瞬时表达的HPPR对迷迭香酸合成代谢的影响。具体结果如下:1.用携带HPPR基因的农杆菌侵染本生烟,侵染后第3天HPPR蛋白的表达量最高,以后逐渐降低,到第8天时表达量几乎检测不到。而当HPPR基因农杆菌与沉默抑制子基因农杆菌混合侵染时,HPPR的表达量较单独侵染有明显提高。侵染后第5天,p25引起HPPR表达量增加3-5倍,p19则可引起HPPR蛋白表达增加10倍。到侵染后第8天,有抑制子存在的情况下,HPPR仍有表达,且p19对HPPR表达增强作用更明显。2. HPLC分析表明,用携带HPPR基因的农杆菌侵染彩叶草时,侵染后第三天迷迭香酸含量达到最高（干重的2.7%）,而侵染5-8天后,含量逐渐降低,第8天时与未经处理的彩叶草迷迭香酸含量（干重的0.946%）基本一致。当携带有HPPR和p25基因的农杆菌共侵染彩叶草时,迷迭香酸的含量在侵染后3、5、8天分别为干重的4.05%、5.56%、2.83%。当携带有HPPR和p19基因的农杆菌共侵染彩叶草时,迷迭香酸的含量在侵染后3、5、8天分别为干重的6.75%、7.65%、4.78%。结合western blot和HPLC结果我们可以看出,HPPR蛋白表达水平能明显地影响迷迭香酸含量,两者大致呈正相关,当HPPR蛋白表达量高时,迷迭香酸的含量相应的就高,最高可达处理前的8倍。3.构建p25原核表达载体,并在大肠杆菌BL21 （DE3） pLysS中过量表达融合蛋白,免疫小鼠,测定抗血清效价为1:4,000,抗血清和PVX有特异性反应（P/N>2）,和PVY、TMV则无。研究表明,制备的抗血清可用于ELISA检测PVX感病植株及Western blot检测转基因烟草中p25的表达。

论文目录

• 符号及缩略词说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 基因沉默现象的研究进展
• 1.1 生物界RNA 沉默现象的发现
• 1.2 基因沉默的分类和特点
• 1.3 RNA 沉默的分子机制
• 1.4 RNA 沉默的生物学意义和应用
• 1.5 RNA 沉默抑制子
• 2 农杆菌介导的真空渗透瞬时表达体系
• 3 迷迭香酸的生物学特性及合成途径
• 3.1 迷迭香酸的结构及在植物中的分布
• 3.2 迷迭香酸的生物活性
• 3.3 迷迭香酸的合成
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 p25 对 HPPR 的瞬时表达量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 p25 基因的克隆
• 2.2 p19 基因的克隆
• 2.3 HPPR 基因的克隆及抗血清制备
• 2.4 pBI121-p25、pBI121-p19、pBI121-HPPR 载体构建与鉴定
• 2.5 农杆菌侵染的本生烟中HPPR 蛋白水平鉴定
• 2.6 农杆菌侵染的彩叶草中HPPR 蛋白水平鉴定
• 2.7 彩叶草中迷迭香酸的定性分析
• 2.8 彩叶草中迷迭香酸的定量分析
• 3 讨论
• 3.1 p25/p19 提高了 HPPR 的表达量
• 3.2 瞬时表达的HPPR 蛋白能促进终产物迷迭香酸的合成
• 第三章 马铃薯 X 病毒 MP 基因原核表达、抗血清制备及应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 p25 基因的获得
• 1.2.2 p25 抗血清的制备、效价测定及特异性检测
• 1.2.3 Western blot 检测 p25 转基因烟草
• 2 结果与分析
• 2.1 p25 基因的克隆
• 2.2 原核表达载体的构建
• 2.3 p25 融合蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 电泳检测
• 2.4 抗血清制备、效价测定及特异性检测
• 2.5 利用制得抗血清检测稳定表达的 p25 转基因烟草
• 3 讨论
• 3.1 采用分子生物学方法制备抗血清的优点
• 3.2 诱导条件的优化
• 3.3 应用前景
• 小结
• 参考文献
• 附录Ⅰ常用缓冲液及培养基的配制
• 附录Ⅱ常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 致谢
• 硕士研究生阶段发表的论文