绝缘子HS4的不同区域对于杆状病毒基因表达的影响

论文摘要

关于病毒感染和复制过程中的表观遗传学调控多集中于具有潜伏期的病毒,如Epstein-Barr病毒（EBV）,单纯疱疹病毒（HSV）或是乙型肝炎病毒（HBV）,而对于裂解性复制病毒相关研究则比较少。在本实验室之前的研究发现插入在杆状病毒polyhedrin位点下游的鸡β球蛋白绝缘子HS4（hypersensitive site4）可以显著提高polyhedrin启动自控制的报告基因的表达水平。本研究进一步探索了绝缘子HS4的不同区域在杆状病毒裂解性复制过程中对于基因表达的调控。绝缘子HS4是位于鸡β球蛋白基因座5’端上游20kb处的一段序列,具有阻断增强子和屏蔽异染色质扩散的作用。通常认为其发挥功能依赖于位于5’端的250bp核心区,其中CTCF区负责增强子的阻断,而USF区可以招募USF1/2因子并进一步招募组蛋白乙酰化酶等以维持周围染色体的乙酰化,避免异染色质的扩散。然而也有研究指出核心区域及3’端400bp区域对于发挥绝缘子的作用都是必须的。在本研究中,首先通过PCR获得了HS4绝缘子的不同区域,分别将其插入杆状病毒polyhedrin启动子带动报告基因egfp表达框的下游。共构建了6株重组病毒,分别为带有HS45’端核心区域250bp的vBGc,敲除5’端核心区域和3’端区域的vBG550,带有5’端核心区域与3’端区域连接片段的vBG650,敲除5’端核心区域的vBG950,全长HS4的vBG’,以及作为对照未插入任何HS4片段的vGFP。通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测,发现在感染Sf9细胞36h时,各病毒之间的EGFP表达差异最为明显。。其中vBG,以及vBG650的EGFP表达量相比对照病毒有明显提高,约提高了2倍左右,而其他几株病毒并没有明显差异。本实验的结果与前人在哺乳细胞中的实验结果基本相符,进一步证明了HS4可以通过影响病毒载体中报告基因的表达,提示在裂解性复制过程中,表观遗传学修饰对病毒基因的表达起着重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 综述
• 一、杆状病毒
• 1. 杆状病毒的基本特征
• 2. 杆状病毒的生活周期
• 二、杆状病毒-昆虫表达系统用于表达外源蛋白
• 1. 杆状病毒表达载体的基本原理
• 2. 重组杆状病毒的构建
• 3. 杆状病毒-昆虫表达系统的优点和缺点
• 三、绝缘子
• 1. 绝缘子的简介
• 2. HS4绝缘子
• 3. 绝缘子的作用机制
• 参考文献
• 第二部分 实验
• 一、引言
• 二、材料与方法
• Ⅰ. 实验仪器
• Ⅱ. 实验材料和试剂
• Ⅲ. 实验方法
• 三、结果与分析
• 1. HS4绝缘子不同区域的片段的获得
• 2. 质粒的构建
• 3. 重组Bacmid和病毒的获得
• 4. 病毒效价的测定
• 5. HS4绝缘子不同片段对绿色荧光蛋白在Sf9昆虫细胞中表达的影响
• 四、讨论
• 五、参考文献
• 六、附录
• 致谢