粉纹夜蛾离体细胞诱导抗菌肽基因的cDNA克隆与序列分析

论文摘要

抗菌肽是生物体内由特定基因编码产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽。广泛存在于昆虫、两栖动物、甲壳动物、软体动物、鱼类、鸟类、植物、哺乳动物等生物体内，具有广谱抗菌、抗病毒、抑制肿瘤的生物活性和很好的应用前景。第一种抗菌肽是从昆虫中鉴定出来的，昆虫成为研究抗菌肽的首选生物。在诱导和非诱导的情况下，昆虫能产生各种类型的抗菌肽，参与机体对入侵病原微生物的免疫应答反应，是机体免疫系统中对抗外界感染的重要防线。目前，这些研究主要集中在活体上，随着研究的深入，由于离体细胞在分子水平研究基因性质的优越性，越来越多的研究者尝试用离体培养的昆虫细胞来研究昆虫抗菌肽的诱导和表达。实验已证明用脂多糖、昆布多糖、鞭毛蛋白以及热灭活的大肠杆菌等物质诱导果蝇、棕尾别麻蝇、墨西哥棉铃象、白纹伊蚊、粉纹夜蛾等昆虫的细胞系表达了抗菌肽。本实验室已成功的利用大肠杆菌DH5α诱导粉纹夜蛾Trichoplusia ni卵细胞系克隆株BTI-Tn-5B1细胞产生了抗菌活性物质，初步判断其为尚未发现并鉴定的抗菌肽。为了进一步验证这一结果并获得其基因序列，本实验对经大肠杆菌DH5α诱导的Tn-5B1中产生的物质进行抗菌活性检测后，通过Trcine SDS-PAGE分离出差异蛋白带，将差异蛋白带经PVDF转膜后利用Edaman降解法测定其N末端10个氨基酸序列，据此设计基因特异性引物，提取5B1细胞总RNA，采用3’RACE法分离克隆待鉴定的抗菌肽cDNA序列，并对所得基因序列进行生物信息学分析。结果如下：（1） 5B1细胞经灭活的Ecoli诱导后所产生的诱导产物有一定的抑菌活性。（2） Tricine SDS-PAGE分析了5B1细胞诱导样品比对照样品多出1条较为明显的蛋白带，分子量在8KD左右。（3）差异带N端10个氨基酸序列为A-V-N-V-E-T（A）-I（D）-A-A-V。（4）将3’RACE克隆得到的目的基因测序，并推断其氨基酸序列及分子量。该cDNA序列全长为430bp，其中包括216bp（不完整）开放阅读框，推测编码72个氨基酸的多肽，分子量约为7490KD，等电点pI为4.17，同时含有214bp的3’非转译区。其N末端10个氨基酸序列与Edman降解法所得的氨基酸序列完全一致，分子量也与Tiscine SDS-PAGE显示的差异条带分子量接近。因此，初步判断其为抗菌肽基因。（5）将所得基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，结果显示该基因与核糖体基因有较高的同源性，而与已报道的抗菌肽基因基本没有同源性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 昆虫抗菌肽的分子结构及种类
• 1.1.1 天蚕素类
• 1.1.2 昆虫防御素
• 1.1.3 富含脯氨酸的抗菌肽
• 1.1.4 富含甘氨酸的抗菌肽
• 1.1.5 抗真菌肽
• 1.2 昆虫抗菌肽的作用及机理
• 1.2.1 抗菌肽的抗菌作用及其机理
• 1.2.2 抗菌肽的抗病毒作用及其机理
• 1.2.3 抗菌肽对某些原生动物的作用及其机理
• 1.2.4 抗菌肽对肿瘤细胞作用及其机理
• 1.2.5 抗菌肽其他作用及其机理
• 1.3 昆虫抗菌肽的应用前景
• 1.3.1 医药领域
• 1.3.2 农业领域
• 1.3.3 食品工业和化妆品领域
• 1.4 昆虫抗菌肽的分子生物学研究
• 1.4.1 昆虫抗菌肽基因的分子组成
• 1.4.2 昆虫抗菌肽基因的克隆和表达系统的研究
• 1.4.3 抗菌肽的转基因研究
• 1.5 RACE技术简介
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2.实验材料
• 2.1 供试细胞系、菌株及质粒
• 2.2 昆虫细胞培养基及细菌培养基
• 2.2.1 昆虫细胞培养基
• 2.2.2 细菌培养基
• 2.3 实验所用试剂
• 2.3.1 酶、常规试剂及试剂盒
• 2.3.2 常用溶液及配制
• 2.4 分子量标准
• 2.5 实验仪器及设备
• 3.实验方法
• 3.1 5B1细胞抗菌活性物质的提取及电泳分析
• 3.1.1 细胞培养
• 3.1.2 抗菌活性物质的诱导
• 3.2 抗菌活性物质的转膜及N端序列测定
• 3.3 PCR引物设计
• 3.4 5B1细胞总RNA的抽提制备
• 3.5 3,RACE
• 3.5.1 逆转录
• 3.5.2 目标DNA链的扩增
• 3.6 PCR产物的提纯及连接
• 3.6.1 PCR产物的回收
• 3.6.2 连接
• 3.7 E.coli DH5a感受态细胞的制备,转化及阳性克隆的鉴定
• 3.7.1 感受态细胞的制备
• 3.7.2 重组质粒的转化
• 3.7.3 阳性克隆的筛选与鉴定
• 3.8 DNA序列测定
• 3.9 cDNA序列生物信息学分析
• 4.结果及分析
• 4.1 抗菌活性物质抑菌活性鉴定
• 4.2 抗菌活性物质Trcine SDS-PAGE电泳结果
• 4.3 蛋白质N端序列及引物设计
• 4.4 RNA提取及质量评估
• 4.5 3’-RACE结果
• 4.6 重组克隆载体的鉴定——菌落PCR法
• 4.7 重组克隆载体的序列测定
• 4.8.HABP基因及其编码序列的生物信息学分析
• 4.8.1 DNAman软件分析结果
• 4.8.2 BLAST比对结果
• 4.8.3 利用SignalP 3.0 Server进行信号肽预测
• 4.8.4 利用Porter分析编码蛋白的二级结构
• 4.8.5 利用interPro Scan对编码的蛋白进行综合分析结果
• 5.讨论
• 5.1 离体细胞诱导抗菌肽的研究
• 5.2 Tricine SDS-PAGE电泳方法分析诱导产物
• 5.3 目的基因的克隆
• 5.3.1 GSP的设计
• 5.3.2 RNA的提取
• 5.3.3 PCR扩增
• 5.4 所得序列的生物信息学分析
• 5.5 关于本实验后续工作的设想
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢